Differinsjaaldiagnoaze fan longnodules identifisearre troch kompjûtertomografy (CT) bliuwt in útdaging yn 'e klinyske praktyk. Hjir karakterisearje wy it globale metaboloom fan 480 serummonsters, ynklusyf sûne kontrôles, goedaardige longnodules en longadenokarsinoom yn stadium I. Adenokarsinomen litte unike metabolomyske profilen sjen, wylst goedaardige nodules en sûne yndividuen in hege oerienkomst hawwe yn metabolomyske profilen. Yn 'e ûntdekkingsgroep (n = 306) waard in set fan 27 metaboliten identifisearre om ûnderskied te meitsjen tusken goedaardige en maligne nodules. De AUC fan it diskriminantmodel yn 'e ynterne falidaasje (n = 104) en eksterne falidaasje (n = 111) groepen wie respektivelik 0.915 en 0.945. Paadanalyse liet ferhege glykolytyske metaboliten sjen dy't ferbûn binne mei fermindere tryptofaan yn longadenokarsinoomserum yn ferliking mei goedaardige nodules en sûne kontrôles, en suggerearre dat tryptofaanopname glykolyse yn longkankersellen befoarderet. Us stúdzje beklammet de wearde fan serummetabolietbiomarkers by it beoardieljen fan it risiko fan longnodules ûntdutsen troch CT.
Iere diagnoaze is krúsjaal om de oerlibjenssifers foar kankerpasjinten te ferbetterjen. Resultaten fan 'e Amerikaanske Nasjonale Lung Cancer Screening Trial (NLST) en de Jeropeeske NELSON-stúdzje hawwe oantoand dat screening mei lege-dosis kompjûtertomografy (LDCT) de mortaliteit fan longkanker yn groepen mei hege risiko's signifikant kin ferminderje1,2,3. Sûnt it wiidfersprate gebrûk fan LDCT foar screening op longkanker is de ynsidinsje fan tafallige radiografyske befiningen fan asymptomatyske longknobbels bleau tanimmen4. Longknobbels wurde definiearre as fokale opasiteiten oant 3 sm yn diameter5. Wy hawwe swierrichheden by it beoardieljen fan 'e kâns op maligniteit en it omgean mei it grutte oantal longknobbels dat tafallich op LDCT ûntdutsen wurdt. Beperkingen fan CT kinne liede ta faak neiûndersyk en falsk-positive resultaten, wat liedt ta ûnnedige yntervinsje en oerbehanneling6. Dêrom is it nedich om betroubere en brûkbere biomarkers te ûntwikkeljen om longkanker yn 'e iere stadia korrekt te identifisearjen en de measte goedaardige knobbels by de earste deteksje te ûnderskieden7.
Wiidweidige molekulêre analyze fan bloed (serum, plasma, perifeare bloedmononukleêre sellen), ynklusyf genomika, proteomika of DNA-metylaasje8,9,10, hat laat ta groeiende belangstelling foar de ûntdekking fan diagnostyske biomarkers foar longkanker. Underwilens mjitte metabolomika-oanpakken sellulêre einprodukten dy't beynfloede wurde troch endogene en eksogene aksjes en wurde dêrom tapast om it begjin en de útkomst fan 'e sykte te foarsizzen. Floeibere chromatografy-tandem massaspektrometry (LC-MS) is in breed brûkte metoade foar metabolomika-stúdzjes fanwegen syn hege gefoelichheid en grutte dynamyske berik, dy't metaboliten mei ferskate fysyk-gemyske eigenskippen11,12,13 kin dekke. Hoewol globale metabolomika-analyze fan plasma/serum is brûkt om biomarkers te identifisearjen dy't ferbûn binne mei longkankerdiagnoaze14,15,16,17 en behannelingseffektiviteit,18 moatte serummetabolietklassifikatoaren om ûnderskied te meitsjen tusken goedaardige en maligne longnodules noch in soad bestudearre wurde. -massaal ûndersyk.
Adenokarsinoom en plaveiselselkarsinoom binne de twa wichtichste subtypen fan net-lytse sel longkanker (NSCLC). Ferskate CT-screeningstests jouwe oan dat adenokarsinoom it meast foarkommende histologyske type longkanker is1,19,20,21. Yn dizze stúdzje hawwe wy ultra-prestaasje floeistofchromatografy-hege-resolúsje massaspektrometry (UPLC-HRMS) brûkt om metabolomika-analyze út te fieren op in totaal fan 695 serummonsters, ynklusyf sûne kontrôles, goedaardige longnodules en CT-detektearre ≤3 sm. Screening foar longadenokarsinoom yn stadium I. Wy hawwe in paniel fan serummetaboliten identifisearre dy't longadenokarsinoom ûnderskiede fan goedaardige nodules en sûne kontrôles. Paadferrikingsanalyze liet sjen dat abnormaal tryptofaan- en glukosemetabolisme faak foarkommende feroarings binne yn longadenokarsinoom yn ferliking mei goedaardige nodules en sûne kontrôles. Uteinlik hawwe wy in serummetabolisme-klassifikator mei hege spesifisiteit en gefoelichheid fêststeld en validearre om ûnderskied te meitsjen tusken maligne en goedaardige longnodules dy't ûntdutsen binne troch LDCT, wat kin helpe by iere differinsjaaldiagnoaze en risikobeoardieling.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waarden serummonsters fan geslacht en leeftyd retrospektyf sammele fan 174 sûne kontrôles, 292 pasjinten mei goedaardige longnodules en 229 pasjinten mei longadenokarsinoom yn stadium I. Demografyske skaaimerken fan 'e 695 ûnderwerpen wurde werjûn yn Oanfoljende Tabel 1.
Lykas te sjen is yn figuer 1a, waarden yn totaal 480 serummonsters, ynklusyf 174 sûne kontrôles (HC), 170 goedaardige nodules (BN), en 136 longadenokarsinoom (LA)-monsters yn stadium I, sammele by it Sun Yat-sen University Cancer Center. Untdekkingskohort foar net-rjochte metabolomyske profilering mei help fan ultra-performance floeistofchromatografy-hege-resolúsje massaspektrometry (UPLC-HRMS). Lykas te sjen is yn oanfoljende figuer 1, waarden ferskillende metaboliten tusken LA en HC, LA en BN identifisearre om in klassifikaasjemodel te fêstigjen en fierder de analyze fan ferskillende paadwizen te ûndersiikjen. 104 samples sammele troch it Sun Yat-sen University Cancer Center en 111 samples sammele troch twa oare sikehûzen waarden ûnderwurpen oan ynterne en eksterne falidaasje, respektivelik.
in Studiepopulaasje yn 'e ûntdekkingskohort dy't wrâldwide serummetabolomika-analyze ûndergie mei ultra-prestaasjes floeistofchromatografy-hege-resolúsje massaspektrometry (UPLC-HRMS). b Partielle minste kwadraten diskriminantanalyze (PLS-DA) fan it totale metaboloom fan 480 serummonsters út 'e stúdzjekohort, ynklusyf sûne kontrôles (HC, n = 174), goedaardige nodules (BN, n = 170), en stadium I longadenokarsinoom (Los Angeles, n = 136). +ESI, positive elektrospray-ionisaasjemodus, -ESI, negative elektrospray-ionisaasjemodus. c–e Metaboliten mei signifikant ferskillende oerfloeden yn twa opjûne groepen (twasidige Wilcoxon-tekene rangtest, falske ûntdekkingsrate oanpaste p-wearde, FDR <0,05) wurde werjûn yn read (foldferoaring > 1,2) en blau (foldferoaring < 0,83). ) werjûn op 'e fulkaangrafyk. f Hiërargyske klusterjende waarmtekaart dy't signifikante ferskillen sjen lit yn it oantal annotearre metaboliten tusken LA en BN. Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
It totale serummetaboloom fan 174 HC, 170 BN en 136 LA yn 'e ûntdekkingsgroep waard analysearre mei UPLC-HRMS-analyze. Wy litte earst sjen dat kwaliteitskontrôle (QC)-samples ticht byinoar klusterje yn it sintrum fan in net-begeliede haadkomponintanalyze (PCA)-model, wat de stabiliteit fan 'e prestaasjes fan' e hjoeddeiske stúdzje befêstiget (Oanfoljende figuer 2).
Lykas te sjen is yn 'e partielle minste kwadraten-diskriminantanalyse (PLS-DA) yn figuer 1b, fûnen wy dat der dúdlike ferskillen wiene tusken LA en BN, LA en HC yn positive (+ESI) en negative (-ESI) elektrospray-ionisaasjemodi. Der waarden lykwols gjin wichtige ferskillen fûn tusken BN en HC yn +ESI- en -ESI-omstannichheden.
Wy fûnen 382 ferskillende skaaimerken tusken LA en HC, 231 ferskillende skaaimerken tusken LA en BN, en 95 ferskillende skaaimerken tusken BN en HC (Wilcoxon signed rank test, FDR <0.05 en meardere feroaring >1.2 of <0.83) (figuer .1c-e). . Peaks waarden fierder annotearre (Oanfoljende gegevens 3) tsjin in database (mzCloud/HMDB/Chemspider-bibleteek) troch m/z-wearde, retinsjetiid en fragmintaasjemassaspektrumsykjen (details beskreaun yn 'e seksje Metoaden) 22. Uteinlik waarden 33 en 38 annotearre metaboliten mei wichtige ferskillen yn oerfloed identifisearre foar LA versus BN (figuer 1f en oanfoljende tabel 2) en LA versus HC (oanfoljende figuer 3 en oanfoljende tabel 2), respektivelik. Yn tsjinstelling waarden mar 3 metaboliten mei wichtige ferskillen yn oerfloed identifisearre yn BN en HC (oanfoljende tabel 2), wat oerienkomt mei de oerlaap tusken BN en HC yn PLS-DA. Dizze ferskillende metaboliten dekke in breed skala oan biogemyske stoffen (Oanfoljende figuer 4). Mei-inoar nommen litte dizze resultaten wichtige feroarings sjen yn it serummetaboloom dy't de maligne transformaasje fan longkanker yn in ier stadium reflektearje yn ferliking mei goedaardige longnodules of sûne persoanen. Underwilens suggerearret de oerienkomst fan it serummetaboloom fan BN en HC dat goedaardige longnodules in protte biologyske skaaimerken diele kinne mei sûne persoanen. Mei it each op it feit dat epidermale groeifaktorreseptor (EGFR) genmutaasjes gewoan binne yn longadenokarsinoom subtype 23, hawwe wy besocht de ynfloed fan drivermutaasjes op it serummetaboloom te bepalen. Wy hawwe doe it algemiene metabolomyske profyl analysearre fan 72 gefallen mei EGFR-status yn 'e longadenokarsinoomgroep. Nijsgjirrich is dat wy fergelykbere profilen fûnen tusken EGFR-mutantpasjinten (n = 41) en EGFR wild-typepasjinten (n = 31) yn PCA-analyze (Oanfoljende figuer 5a). Wy hawwe lykwols 7 metaboliten identifisearre wêrfan de oerfloed signifikant feroare wie by pasjinten mei EGFR-mutaasje yn ferliking mei pasjinten mei wild-type EGFR (t-test, p < 0,05 en foldferoaring > 1,2 of < 0,83) (Oanfoljende figuer 5b). De mearderheid fan dizze metaboliten (5 fan de 7) binne acylcarnitines, dy't in wichtige rol spylje yn fetsoeroksidaasjepaden.
Lykas yllustrearre yn 'e workflow werjûn yn Figuer 2a, waarden biomarkers foar noduleklassifikaasje krigen mei gebrûk fan minst absolute krimpoperators en seleksje basearre op 33 ferskillende metaboliten identifisearre yn LA (n = 136) en BN (n = 170). Bêste kombinaasje fan fariabelen (LASSO) - binêr logistysk regresjemodel. Tsienfâldige krúsfalidaasje waard brûkt om de betrouberens fan it model te testen. Fariabeleseleksje en parameterregularisaasje wurde oanpast troch in wierskynlikheidsmaksimalisaasjestraf mei parameter λ24. Globale metabolomika-analyze waard fierder ûnôfhinklik útfierd yn 'e ynterne falidaasje (n = 104) en eksterne falidaasje (n = 111) groepen om de klassifikaasjeprestaasjes fan it diskriminantmodel te testen. As resultaat waarden 27 metaboliten yn 'e ûntdekkingsset identifisearre as it bêste diskriminantmodel mei de grutste gemiddelde AUC-wearde (Fig. 2b), wêrfan 9 ferhege aktiviteit hiene en 18 fermindere aktiviteit yn LA yn ferliking mei BN (Fig. 2c).
Workflow foar it bouwen fan in pulmonale nodule-klassifikator, ynklusyf it selektearjen fan it bêste paniel fan serummetaboliten yn 'e ûntdekkingsset mei in binêr logistysk regresjemodel fia tsienfâldige krúsfalidaasje en it evaluearjen fan foarsizzingsprestaasjes yn ynterne en eksterne falidaasjesets. b Krúsfalidaasjestatistiken fan it LASSO-regresjemodel foar seleksje fan metabolike biomarkers. De hjirboppe jûne sifers fertsjintwurdigje it gemiddelde oantal biomarkers selektearre by in bepaalde λ. De reade stippele line fertsjintwurdiget de gemiddelde AUC-wearde by de oerienkommende lambda. Grize flaterbalken fertsjintwurdigje de minimale en maksimale AUC-wearden. De stippele line jout it bêste model oan mei de 27 selektearre biomarkers. AUC, gebiet ûnder de ûntfanger-operative karakteristyk (ROC)-kromme. c Fâldferoarings fan 27 selektearre metaboliten yn 'e LA-groep yn ferliking mei de BN-groep yn' e ûntdekkingsgroep. Reade kolom - aktivearring. De blauwe kolom is in delgong. d–f Untfanger-operative karakteristyk (ROC)-krommen dy't de krêft fan it diskriminantmodel sjen litte basearre op 27 metabolietkombinaasjes yn 'e ûntdekkings-, ynterne en eksterne falidaasjesets. Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
In foarsizzingsmodel waard makke basearre op 'e gewogen regresjekoëffisiënten fan dizze 27 metaboliten (Oanfoljende Tabel 3). ROC-analyze basearre op dizze 27 metaboliten joech in gebiet ûnder de kromme (AUC) wearde fan 0.933, de gefoelichheid fan 'e ûntdekkingsgroep wie 0.868, en de spesifisiteit wie 0.859 (Fig. 2d). Underwilens, ûnder de 38 annotearre ferskillende metaboliten tusken LA en HC, berikte in set fan 16 metaboliten in AUC fan 0.902 mei in gefoelichheid fan 0.801 en spesifisiteit fan 0.856 by it ûnderskieden fan LA fan HC (Oanfoljende Figuer 6a-c). AUC-wearden basearre op ferskate foldferoaringsdrompelwearden foar ferskillende metaboliten waarden ek fergelike. Wy fûnen dat it klassifikaasjemodel it bêste prestearre by it ûnderskieden tusken LA en BN (HC) doe't it foldferoaringsnivo ynsteld wie op 1.2 versus 1.5 of 2.0 (Oanfoljende Figuer 7a,b). It klassifikaasjemodel, basearre op 27 metabolietgroepen, waard fierder validearre yn ynterne en eksterne kohorten. De AUC wie 0.915 (gefoelichheid 0.867, spesifisiteit 0.811) foar ynterne falidaasje en 0.945 (gefoelichheid 0.810, spesifisiteit 0.979) foar eksterne falidaasje (Fig. 2e, f). Om de ynterlaboratoariumeffisjinsje te beoardieljen, waarden 40 samples út 'e eksterne kohort analysearre yn in ekstern laboratoarium lykas beskreaun yn 'e seksje Metoaden. De klassifikaasjenauwkeurigens berikte in AUC fan 0.925 (Oanfoljende figuer 8). Omdat longplaveiselselkarsinoom (LUSC) it twadde meast foarkommende subtype fan net-lytse sel longkanker (NSCLC) is nei longadenokarsinoom (LUAD), hawwe wy ek it validearre potinsjele nut fan metabolike profilen testen. BN en 16 gefallen fan LUSC. De AUC fan ûnderskied tusken LUSC en BN wie 0.776 (Oanfoljende figuer 9), wat in minder goed ûnderskiedend fermogen oanjout yn ferliking mei ûnderskied tusken LUAD en BN.
Undersyk hat oantoand dat de grutte fan knobbeltsjes op CT-ôfbyldings posityf korrelearre is mei de kâns op maligniteit en in wichtige bepalende faktor bliuwt foar de behanneling fan knobbeltsjes25,26,27. Analyse fan gegevens út 'e grutte kohort fan' e NELSON-screeningsstúdzje liet sjen dat it risiko op maligniteit by ûnderwerpen mei knobbeltsjes <5 mm sels fergelykber wie mei dat by ûnderwerpen sûnder knobbeltsjes28. Dêrom is de minimale grutte dy't regelmjittige CT-monitoring fereasket 5 mm, lykas oanrikkemandearre troch de British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, lykas oanrikkemandearre troch de Fleischner Society29. Knobbeltsjes grutter as 6 mm en sûnder dúdlike goedaardige skaaimerken, neamd ûnbepaalde pulmonale knobbeltsjes (IPN), bliuwe lykwols in grutte útdaging yn evaluaasje en behear yn 'e klinyske praktyk30,31. Wy hawwe dêrnei ûndersocht oft de grutte fan 'e knobbeltsjes ynfloed hie op metabolomyske hantekeningen mei help fan gearfoege samples út 'e ûntdekkings- en ynterne falidaasjekohorten. Mei fokus op 27 validearre biomarkers hawwe wy earst de PCA-profilen fan HC- en BN sub-6 mm metabolomen fergelike. Wy fûnen dat de measte gegevenspunten foar HC en BN oerlaapten, wat oantoande dat de serummetabolietnivo's yn beide groepen fergelykber wiene (Fig. 3a). De skaaimerkenkaarten oer ferskate grutteberik bleauwen bewarre yn BN en LA (Fig. 3b, c), wylst in skieding waarnommen waard tusken maligne en goedaardige nodules yn it berik fan 6-20 mm (Fig. 3d). Dizze kohort hie in AUC fan 0.927, spesifisiteit fan 0.868, en gefoelichheid fan 0.820 foar it foarsizzen fan 'e maligniteit fan nodules mei in grutte fan 6 oant 20 mm (Fig. 3e, f). Us resultaten litte sjen dat de klassifikator metabolike feroarings kin fange dy't feroarsake wurde troch iere maligne transformaasje, nettsjinsteande de grutte fan 'e nodule.
ad Ferliking fan PCA-profilen tusken spesifisearre groepen basearre op in metabolike klassifikator fan 27 metaboliten. CC en BN < 6 mm. b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm. yn LA 6–20 mm versus LA 20–30 mm. g BN 6–20 mm en LA 6–20 mm. GC, n = 174; BN < 6 mm, n = 153; BN 6–20 mm, n = 91; LA 6–20 mm, n = 89; LA 20–30 mm, n = 77. e Untfanger-operaasjekarakteristyk (ROC)-kromme dy't de prestaasjes fan it diskriminantmodel sjen lit foar nodules fan 6–20 mm. f Kânswearden waarden berekkene op basis fan it logistyk regresjemodel foar nodules mei in grutte fan 6–20 mm. De grize stippele line fertsjintwurdiget de optimale ôfsnijwearde (0.455). De boppesteande sifers fertsjintwurdigje it persintaazje gefallen dat projektearre wurdt foar Los Angeles. Brûk in twasidige Student's t-test. PCA, haadkomponintanalyze. AUC-gebiet ûnder de kromme. Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
Fjouwer stekproeven (fan 44-61 jier âld) mei ferlykbere grutte fan longnodules (7-9 mm) waarden fierder selektearre om de prestaasjes fan it foarstelde model foar it foarsizzen fan maligniteit te yllustrearjen (Fig. 4a, b). By de earste screening presintearre Geval 1 him as in fêste knobbel mei kalsifikaasje, in skaaimerk dat assosjeare wurdt mei goedaardichheid, wylst Geval 2 him presintearre as in ûnbepaalde, foar in part fêste knobbel sûnder dúdlike goedaardige skaaimerken. Trije rûndes fan follow-up CT-scans lieten sjen dat dizze gefallen oer in perioade fan 4 jier stabyl bleaunen en dêrom as goedaardige knobbels beskôge waarden (Fig. 4a). Yn ferliking mei klinyske evaluaasje fan seriële CT-scans identifisearre single-shot serummetabolietanalyse mei it hjoeddeistige klassifikaasjemodel dizze goedaardige knobbels fluch en korrekt op basis fan probabilistyske beheiningen (Tabel 1). Figuer 4b yn gefal 3 lit in knobbel sjen mei tekens fan pleurale weromlûking, dy't it meast assosjeare wurdt mei maligniteit32. Geval 4 presintearre him as in ûnbepaalde, foar in part fêste knobbel sûnder bewiis fan in goedaardige oarsaak. Al dizze gefallen waarden foarsein as maligne neffens it klassifikatormodel (Tabel 1). De beoardieling fan longadenokarsinoom waard demonstrearre troch histopatologysk ûndersyk nei longreseksjeoperaasje (Fig. 4b). Foar de eksterne falidaasjeset foarsei de metabolike klassifikator sekuer twa gefallen fan ûnbepaalde longnodules grutter as 6 mm (Oanfoljende figuer 10).
CT-ôfbyldings fan it axiale finster fan 'e longen fan twa gefallen fan goedaardige knobbels. Yn gefal 1 liet in CT-scan nei 4 jier in stabile fêste knobbel sjen fan 7 mm mei kalsifikaasje yn 'e rjochter ûnderkwab. Yn gefal 2 liet in CT-scan nei 5 jier in stabile, foar in part fêste knobbel sjen mei in diameter fan 7 mm yn 'e rjochter boppekwab. b Axiale finster CT-ôfbyldings fan 'e longen en oerienkommende patologyske stúdzjes fan twa gefallen fan stadium I adenokarsinoom foar longreseksje. Gefal 3 liet in knobbel sjen mei in diameter fan 8 mm yn 'e rjochter boppekwab mei pleurale weromlûking. Gefal 4 liet in foar in part fêste matglêsknobbel sjen fan 9 mm yn 'e linker boppekwab. Hematoxyline en eosine (H&E) kleuring fan resekteare longweefsel (skaalbalke = 50 μm) dy't it asynêre groeipatroan fan longadenokarsinoom sjen litte. Pylken jouwe knobbels oan dy't op CT-ôfbyldings ûntdutsen binne. H&E-ôfbyldings binne represintative ôfbyldings fan meardere (>3) mikroskopyske fjilden dy't troch de patolooch ûndersocht binne.
Mei-inoar litte ús resultaten de potinsjele wearde sjen fan serummetabolietbiomarkers yn 'e differinsjaaldiagnoaze fan longnodules, wat útdagings kin foarmje by it evaluearjen fan CT-screening.
Op basis fan in validearre differinsjaal metabolietpaniel, hawwe wy besocht biologyske korrelaten fan grutte metabolike feroarings te identifisearjen. KEGG-paadferrikingsanalyze troch MetaboAnalyst identifisearre 6 mienskiplike signifikant feroare paden tusken de twa opjûne groepen (LA vs. HC en LA vs. BN, oanpaste p ≤ 0.001, effekt > 0.01). Dizze feroarings waarden karakterisearre troch steurnissen yn pyruvaatmetabolisme, tryptofaanmetabolisme, niacine- en nicotinamidemetabolisme, glykolyse, de TCA-syklus, en purinemetabolisme (Fig. 5a). Wy hawwe doe fierder rjochte metabolomika útfierd om grutte feroarings te ferifiearjen mei absolute kwantifikaasje. Bepaling fan mienskiplike metaboliten yn faak feroare paden troch triple quadrupole massaspektrometry (QQQ) mei autentike metabolietstanderts. Demografyske skaaimerken fan 'e doelgroep fan' e metabolomics-stúdzje binne opnommen yn Oanfoljende Tabel 4. Yn oerienstimming mei ús wrâldwide metabolomics-resultaten befêstige kwantitative analyze dat hypoxanthine en xanthine, pyruvaat en laktaat ferhege wiene yn LA yn ferliking mei BN en HC (Fig. 5b, c, p <0.05). D'r waarden lykwols gjin wichtige ferskillen yn dizze metaboliten fûn tusken BN en HC.
KEGG-paadferrikingsanalyse fan signifikant ferskillende metaboliten yn 'e LA-groep yn ferliking mei de BN- en HC-groepen. In twasidige Globaltest waard brûkt, en p-wearden waarden oanpast mei de Holm-Bonferroni-metoade (oanpast p ≤ 0.001 en effektgrutte > 0.01). b–d Fioelplots dy't hypoxanthine-, xanthine-, laktaat-, pyruvaat- en tryptofaannivo's sjen litte yn serum HC, BN en LA bepaald troch LC-MS/MS (n = 70 per groep). Wite en swarte stippele linen jouwe respektivelik de mediaan en kwartiel oan. e Fioelplot dy't normalisearre Log2TPM (transkripsjes per miljoen) mRNA-ekspresje fan SLC7A5 en QPRT yn longadenokarsinoom (n = 513) sjen lit yn ferliking mei normaal longweefsel (n = 59) yn 'e LUAD-TCGA-dataset. It wite fakje stiet foar it ynterkwartielberik, de horizontale swarte line yn it midden stiet foar de mediaan, en de fertikale swarte line dy't fan it fakje útrint stiet foar it 95% fertrouwensynterval (CI). f Pearson-korrelaasjeplot fan SLC7A5- en GAPDH-ekspresje yn longadenokarsinoom (n = 513) en normaal longweefsel (n = 59) yn 'e TCGA-dataset. It grize gebiet stiet foar it 95% CI. r, Pearson-korrelaasjekoëffisjint. g Normalisearre sellulêre tryptofaannivo's yn A549-sellen transfektearre mei net-spesifike shRNA-kontrôle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bepaald troch LC-MS/MS. Statistyske analyze fan fiif biologysk ûnôfhinklike samples yn elke groep wurdt presintearre. h Sellulêre nivo's fan NADt (totaal NAD, ynklusyf NAD+ en NADH) yn A549-sellen (NC) en SLC7A5 knockdown A549-sellen (Sh1, Sh2). Statistyske analyze fan trije biologysk ûnôfhinklike samples yn elke groep wurdt presintearre. i Glykolytyske aktiviteit fan A549-sellen foar en nei SLC7A5 knockdown waard metten troch ekstrasellulêre fersuringssnelheid (ECAR) (n = 4 biologysk ûnôfhinklike samples per groep). 2-DG,2-deoxy-D-glukose. Twasidige Student's t-test waard brûkt yn (b-h). Yn (g-i) fertsjintwurdigje flaterbalken it gemiddelde ± SD, elk eksperimint waard trije kear ûnôfhinklik útfierd en de resultaten wiene fergelykber. Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
Mei it each op de wichtige ynfloed fan feroare tryptofaanmetabolisme yn 'e LA-groep, hawwe wy ek serumtryptofaannivo's yn 'e HC-, BN- en LA-groepen beoardiele mei QQQ. Wy fûnen dat serumtryptofaan fermindere wie yn LA yn ferliking mei HC of BN (p < 0.001, Figuer 5d), wat oerienkomt mei eardere befiningen dat sirkulearjende tryptofaannivo's leger binne by pasjinten mei longkanker as yn sûne kontrôles út 'e kontrôlegroep33,34,35. In oare stúdzje mei PET/CT-tracer 11C-methyl-L-tryptofaan fûn dat de tryptofaansignaalretensjetiid yn longkankerweefsel signifikant ferhege wie yn ferliking mei goedaardige laesjes of normaal weefsel36. Wy stelle de hypoteze dat de ôfname fan tryptofaan yn LA-serum in aktive tryptofaanopname troch longkankersellen kin reflektearje.
It is ek bekend dat it einprodukt fan 'e kynurenine-paad fan tryptofaankatabolisme NAD+37,38 is, dat in wichtich substraat is foar de reaksje fan glyceraldehyde-3-fosfaat mei 1,3-bisfosfoglyceraat yn glykolyse39. Wylst eardere stúdzjes har rjochte hawwe op 'e rol fan tryptofaankatabolisme yn ymmúnregeling, hawwe wy besocht de ynteraksje tusken tryptofaandysregeling en glykolytyske paden te ferdúdlikjen dy't yn 'e hjoeddeiske stúdzje waarnommen binne. Oplosmiddeltransporterfamylje 7 lid 5 (SLC7A5) is bekend as in tryptofaantransporter43,44,45. Kinolinezuurfosforibosyltransferase (QPRT) is in enzyme dat streamôfwerts fan 'e kynurenine-paad leit en kinolinezuur omset yn NAMN46. Ynspeksje fan 'e LUAD TCGA-dataset die bliken dat sawol SLC7A5 as QPRT signifikant opregulearre wiene yn tumorweefsel yn ferliking mei normaal weefsel (Fig. 5e). Dizze tanimming waard waarnommen yn stadia I en II, lykas stadia III en IV fan longadenokarsinoom (Oanfoljende figuer 11), wat wiist op iere steurnissen yn it tryptofaanmetabolisme dy't ferbûn binne mei tumorigenese.
Derneist liet de LUAD-TCGA-dataset in positive korrelaasje sjen tusken SLC7A5 en GAPDH mRNA-ekspresje yn kankerpasjintenmonsters (r = 0.45, p = 1.55E-26, figuer 5f). Yn tsjinstelling waard gjin wichtige korrelaasje fûn tusken sokke gensignaturen yn normaal longweefsel (r = 0.25, p = 0.06, figuer 5f). It ûnderdrukken fan SLC7A5 (Oanfoljende figuer 12) yn A549-sellen fermindere sellulêre tryptofaan- en NAD(H)-nivo's signifikant (figuer 5g,h), wat resultearre yn ferswakke glykolytyske aktiviteit mjitten troch ekstrasellulêre fersuringssnelheid (ECAR) (figuer 1). 5i). Sa, basearre op metabolike feroarings yn serum en in vitro-deteksje, stelle wy de hypoteze dat tryptofaanmetabolisme NAD+ kin produsearje fia de kynurenine-paad en in wichtige rol kin spylje by it befoarderjen fan glykolyse by longkanker.
Undersyk hat oantoand dat in grut oantal ûnbepaalde longnodules ûntdutsen troch LDCT kin liede ta de needsaak foar ekstra testen lykas PET-CT, longbiopsie en oerbehanneling fanwegen in falsk-positive diagnoaze fan maligniteit.31 Lykas te sjen is yn figuer 6, identifisearre ús stúdzje in paniel fan serummetaboliten mei potinsjele diagnostyske wearde dy't risikostratifikaasje en it neifolgjende behear fan longnodules ûntdutsen troch CT kinne ferbetterje.
Longnodules wurde evaluearre mei help fan leechdosis kompjûtertomografy (LDCT) mei ôfbyldingsfunksjes dy't suggerearje dat der goedaardige of maligne oarsaken binne. De ûnwisse útkomst fan nodules kin liede ta faak neibesykten, ûnnedige yntervinsjes en oerbehanneling. De opname fan serummetabolismeklassifikatoaren mei diagnostyske wearde kin de risikobeoardieling en it neifolgjende behear fan longnodules ferbetterje. PET-positronemisjetomografy.
Gegevens út 'e Amerikaanske NLST-stúdzje en de Jeropeeske NELSON-stúdzje suggerearje dat it screenen fan groepen mei hege risiko's mei lege-dosis kompjûtertomografy (LDCT) de mortaliteit fan longkanker kin ferminderje1,3. Risikobeoardieling en it neifolgjende klinyske behear fan in grut oantal tafallige longknobbels dy't ûntdutsen binne troch LDCT bliuwe lykwols it meast útdaagjend. It wichtichste doel is om de juste klassifikaasje fan besteande LDCT-basearre protokollen te optimalisearjen troch betroubere biomarkers op te nimmen.
Bepaalde molekulêre biomarkers, lykas bloedmetaboliten, binne identifisearre troch longkanker te fergelykjen mei sûne kontrôles15,17. Yn 'e hjoeddeiske stúdzje hawwe wy ús rjochte op 'e tapassing fan serummetabolomika-analyze om ûnderskied te meitsjen tusken goedaardige en maligne longnodules dy't tafallich ûntdutsen binne troch LDCT. Wy fergelike it globale serummetaboloom fan sûne kontrôle (HC), goedaardige longnodules (BN), en stadium I longadenokarsinoom (LA)-samples mei UPLC-HRMS-analyze. Wy fûnen dat HC en BN ferlykbere metabolike profilen hiene, wylst LA wichtige feroarings liet sjen yn ferliking mei HC en BN. Wy identifisearren twa sets serummetaboliten dy't LA ûnderskiede fan HC en BN.
It hjoeddeiske LDCT-basearre identifikaasjeskema foar goedaardige en maligne knobbels is benammen basearre op 'e grutte, tichtens, morfology en groeisnelheid fan knobbels oer tiid30. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat de grutte fan knobbels nau besibbe is oan 'e kâns op longkanker. Sels by pasjinten mei in heech risiko is it risiko op maligniteit yn knobbels <6 mm <1%. It risiko op maligniteit foar knobbels mei in grutte fan 6 oant 20 mm farieart fan 8% oant 64%30. Dêrom advisearret de Fleischner Society in ôfsnijdiameter fan 6 mm foar routine CT-follow-up.29 Risikobeoardieling en behear fan ûnbepaalde longknobbels (IPN) grutter as 6 mm binne lykwols net adekwaat útfierd31. It hjoeddeiske behear fan oanberne hertsykte is meastentiids basearre op watchful waiting mei faak CT-monitoring.
Op basis fan it validearre metaboloom hawwe wy foar it earst de oerlaap fan metabolomyske sinjaturen oantoand tusken sûne persoanen en goedaardige knobbels <6 mm. De biologyske oerienkomst is yn oerienstimming mei eardere CT-befiningen dat it risiko op maligniteit foar knobbels <6 mm like leech is as foar ûnderwerpen sûnder knobbels.30 It moat opmurken wurde dat ús resultaten ek oantoane dat goedaardige knobbels <6 mm en ≥6 mm in hege oerienkomst hawwe yn metabolomyske profilen, wat suggerearret dat de funksjonele definysje fan goedaardige etiology konsekwint is, nettsjinsteande de grutte fan 'e knobbel. Sa kinne moderne diagnostyske serummetabolitepanielen in inkele assay leverje as in útslutingstest as knobbels yn earste ynstânsje wurde ûntdutsen op CT en potinsjeel seriële monitoring ferminderje. Tagelyk ûnderskiede itselde paniel fan metabolike biomarkers maligne knobbels ≥6 mm yn grutte fan goedaardige knobbels en levere krekte foarsizzingen foar IPN's fan ferlykbere grutte en dûbelsinnige morfologyske skaaimerken op CT-ôfbyldings. Dizze serummetabolismeklassifikator prestearre goed yn it foarsizzen fan 'e maligniteit fan knobbels ≥6 mm mei in AUC fan 0.927. Byinoar nommen jouwe ús resultaten oan dat unike serummetabolomyske sinjaturen spesifyk iere tumor-induzearre metabolike feroarings kinne reflektearje en potinsjele wearde hawwe as risikofoarsizzers, ûnôfhinklik fan 'e grutte fan' e nodule.
It is opmerklik dat longadenokarsinoom (LUAD) en plaveiselselkarsinoom (LUSC) de wichtichste soarten net-lytse sel longkanker (NSCLC) binne. Mei it each op it feit dat LUSC sterk assosjeare is mei tabaksgebrûk47 en LUAD de meast foarkommende histology is fan tafallige longnodules dy't ûntdutsen wurde by CT-screening48, is ús klassifikatormodel spesifyk boud foar stadium I adenokarsinoommonsters. Wang en kollega's rjochten har ek op LUAD en identifisearren njoggen lipide-hantekeningen mei help fan lipidomics om longkanker yn in ier stadium te ûnderskieden fan sûne persoanen17. Wy testen it hjoeddeistige klassifikatormodel op 16 gefallen fan stadium I LUSC en 74 goedaardige nodules en observearren in lege LUSC-foarsizzingsnauwkeurigens (AUC 0.776), wat suggerearret dat LUAD en LUSC har eigen metabolomyske hantekeningen kinne hawwe. Yndied, LUAD en LUSC hawwe oantoand te ferskillen yn etiology, biologyske oarsprong en genetyske ôfwikingen49. Dêrom moatte oare soarten histology opnommen wurde yn trainingsmodellen foar befolkingsbasearre deteksje fan longkanker yn screeningsprogramma's.
Hjir hawwe wy de seis meast foarkommende feroare paden yn longadenokarsinoom identifisearre yn ferliking mei sûne kontrôles en goedaardige nodules. Xanthine en hypoxanthine binne mienskiplike metabolisten fan 'e purinemetabolismepaad. Yn oerienstimming mei ús resultaten wiene tuskenprodukten dy't ferbûn binne mei purinemetabolisme signifikant ferhege yn it serum of weefsels fan pasjinten mei longadenokarsinoom yn ferliking mei sûne kontrôles of pasjinten yn it preinvasive stadium15,50. Ferhege serumxanthine- en hypoxanthinenivo's kinne it anabolisme reflektearje dat nedich is troch rap proliferearjende kankersellen. Dysregeling fan glukosemetabolisme is in bekend skaaimerk fan kankermetabolisme51. Hjir hawwe wy in wichtige tanimming fan pyruvaat en laktaat waarnommen yn 'e LA-groep yn ferliking mei de HC- en BN-groep, wat oerienkomt mei eardere rapporten fan glykolytyske paadôfwikingen yn 'e serummetaboloomprofilen fan net-lytse sellige longkanker (NSCLC) pasjinten en sûne kontrôles. De resultaten binne konsekwint52,53.
Wichtich is dat wy in omkearde korrelaasje seagen tusken pyruvaat en tryptofaanmetabolisme yn it serum fan longadenokarsinomen. Serumtryptofaannivo's wiene fermindere yn 'e LA-groep yn ferliking mei de HC- of BN-groep. Nijsgjirrich is dat in eardere grutskalige stúdzje mei in prospektive kohort fûn dat lege nivo's fan sirkulearjend tryptofaan ferbûn wiene mei in ferhege risiko op longkanker 54. Tryptofaan is in essinsjeel aminosoer dat wy folslein út iten krije. Wy konkludearje dat serumtryptofaanútputting by longadenokarsinoom in rappe útputting fan dizze metaboliet kin reflektearje. It is bekend dat it einprodukt fan tryptofaankatabolisme fia de kynurenine-paad de boarne is fan de novo NAD+ synteze. Omdat NAD+ primêr produsearre wurdt fia de salvage-paad, moat it belang fan NAD+ yn tryptofaanmetabolisme yn sûnens en sykte noch bepaald wurde 46. Us analyze fan 'e TCGA-database liet sjen dat de ekspresje fan 'e tryptofaantransporter solute transporter 7A5 (SLC7A5) signifikant ferhege wie yn longadenokarsinoom yn ferliking mei normale kontrôles en posityf korrelearre wie mei de ekspresje fan it glykolytyske enzyme GAPDH. Eardere stúdzjes hawwe har benammen rjochte op 'e rol fan tryptofaankatabolisme by it ûnderdrukken fan 'e antitumor ymmúnreaksje40,41,42. Hjir demonstrearje wy dat ynhibysje fan tryptofaanopname troch knockdown fan SLC7A5 yn longkankersellen resulteart yn in lettere ôfname fan sellulêre NAD-nivo's en in begeliedende ferswakking fan glykolytyske aktiviteit. Gearfetsjend leveret ús stúdzje in biologyske basis foar feroaringen yn serummetabolisme assosjeare mei maligne transformaasje fan longadenokarsinoom.
EGFR-mutaasjes binne de meast foarkommende driuwende mutaasjes by pasjinten mei NSCLC. Yn ús stúdzje fûnen wy dat pasjinten mei EGFR-mutaasje (n = 41) algemiene metabolike profilen hienen dy't fergelykber wiene mei pasjinten mei wild-type EGFR (n = 31), hoewol wy fermindere serumnivo's fûnen fan guon EGFR-mutantpasjinten by acylcarnitinepasjinten. De fêststelde funksje fan acylcarnitinen is it transportearjen fan acylgroepen fan it cytoplasma nei de mitochondriale matrix, wat liedt ta de oksidaasje fan fettsoeren om enerzjy te produsearjen 55. Yn oerienstimming mei ús befiningen identifisearre in resinte stúdzje ek ferlykbere metaboloomprofilen tusken EGFR-mutant en EGFR wild-type tumors troch it analysearjen fan it globale metaboloom fan 102 longadenokarsinoomweefselmonsters 50. Nijsgjirrich is dat acylcarnitine-ynhâld ek fûn waard yn 'e EGFR-mutantgroep. Dêrom kin fierder ûndersyk nedich wêze oft feroaringen yn acylcarnitinenivo's EGFR-induzearre metabolike feroaringen en de ûnderlizzende molekulêre paden reflektearje.
Ta beslút, ús stúdzje stelt in serummetabolisme-klassifikator fêst foar de differinsjaaldiagnoaze fan longnodules en stelt in workflow foar dy't risikobeoardieling kin optimalisearje en klinysk behear kin fasilitearje op basis fan CT-scanscreening.
Dizze stúdzje waard goedkard troch de Etyske Kommisje fan it Sun Yat-sen University Cancer Hospital, it First Affiliated Hospital fan 'e Sun Yat-sen University, en de Etyske Kommisje fan it Zhengzhou University Cancer Hospital. Yn 'e ûntdekkings- en ynterne falidaasjegroepen waarden 174 sera fan sûne persoanen en 244 sera fan goedaardige knobbels sammele fan persoanen dy't jierlikse medyske ûndersiken ûndergienen by de ôfdieling Kankerkontrôle en Previnsje, it Sun Yat-sen University Cancer Center, en 166 goedaardige serumknobbels. Longadenokarsinoom yn stadium I waarden sammele fan it Sun Yat-sen University Cancer Center. Yn 'e eksterne falidaasjekohort wiene d'r 48 gefallen fan goedaardige knobbels, 39 gefallen fan longadenokarsinoom yn stadium I fan it First Affiliated Hospital fan 'e Sun Yat-sen University, en 24 gefallen fan longadenokarsinoom yn stadium I fan it Zhengzhou Cancer Hospital. It Sun Yat-sen University Cancer Center sammele ek 16 gefallen fan plaveisellongkanker yn stadium I om de diagnostyske mooglikheid fan 'e fêststelde metabolike klassifikator te testen (pasjintkarakteristiken wurde werjûn yn Oanfoljende Tabel 5). Stekproeven út 'e ûntdekkingskohort en ynterne falidaasjekohort waarden sammele tusken jannewaris 2018 en maaie 2020. Stekproeven foar de eksterne falidaasjekohort waarden sammele tusken augustus 2021 en oktober 2022. Om geslachtsfoaroardielen te minimalisearjen, waarden sawat gelikense oantallen manlike en froulike gefallen oan elke kohort tawiisd. Untdekkingsteam en Yntern Beoardielingsteam. It geslacht fan 'e dielnimmers waard bepaald op basis fan selsrapportaazje. Ynformearre tastimming waard krigen fan alle dielnimmers en der waard gjin kompensaasje fersoarge. Underwerpen mei goedaardige nodules wiene dyjingen mei in stabile CT-scanskoare nei 2 oant 5 jier op it momint fan analyze, útsein 1 gefal út 'e eksterne falidaasjestekproef, dy't preoperatyf sammele waard en diagnostisearre troch histopatology. Mei útsûndering fan groanyske bronchitis. Longadenokarsinoomgefallen waarden sammele foar longreseksje en befêstige troch patologyske diagnoaze. Fêstende bloedmonsters waarden sammele yn serumskiedingsbuizen sûnder antikoagulantia. Bloedmonsters waarden 1 oere by keamertemperatuer stold en doe sintrifugearre by 2851 × g foar 10 minuten by 4 °C om serumsupernatant te sammeljen. Serumaliquots waarden beferzen by -80 °C oant de ekstraksje fan metaboliten. De ôfdieling Kankerprevinsje en Medysk Undersyk fan it Sun Yat-sen University Cancer Center sammele in pool fan serum fan 100 sûne donors, ynklusyf in lykweardich oantal manlju en froulju fan 40 oant 55 jier. Gelike folumes fan elk donormonster waarden mingd, de resultearjende pool waard aliquotearre en opslein by -80 °C. It serummingsel waard brûkt as referinsjemateriaal foar kwaliteitskontrôle en gegevensstanderdisearring.
Referinsjeserum en testmonsters waarden ûntdooid en metaboliten waarden ekstrahearre mei in kombineare ekstraksjemetoade (MTBE/methanol/wetter) 56. Koartsein, 50 μl serum waard mingd mei 225 μl iiskâlde methanol en 750 μl iiskâlde methyl tert-butylether (MTBE). Roer it mingsel en ynkubearje it 1 oere op iis. De monsters waarden doe mingd en vortex-mingd mei 188 μl MS-kwaliteit wetter mei ynterne standerts (13C-laktaat, 13C3-pyruvaat, 13C-methionine en 13C6-isoleucine, kocht fan Cambridge Isotope Laboratories). It mingsel waard doe sintrifugearre by 15.000 × g foar 10 minuten by 4 °C, en de legere faze waard oerbrocht nei twa buizen (125 μL elk) foar LC-MS-analyze yn positive en negative modi. Uteinlik waard it monster yn in hege-snelheid fakuümkonsentrator droech ferdampt.
De droege metaboliten waarden rekonstrueare yn 120 μl fan 80% acetonitril, 5 minuten vortexed, en sintrifugearre by 15.000 × g foar 10 minuten by 4 °C. Supernatanten waarden oerbrocht nei amber glêzen fleskes mei mikro-ynserts foar metabolomics-stúdzjes. Ungerichte metabolomics-analyze op in ultra-performance floeistofchromatografy-hege-resolúsje massaspektrometry (UPLC-HRMS) platfoarm. Metaboliten waarden skieden mei in Dionex Ultimate 3000 UPLC-systeem en in ACQUITY BEH Amide-kolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters). Yn positive ionmodus wiene de mobile fazen 95% (A) en 50% acetonitril (B), elk mei 10 mmol/L ammoniumacetaat en 0.1% mierensoer. Yn negative modus befette mobile fazen A en B respektivelik 95% en 50% acetonitril, beide fazen befette 10 mmol/L ammoniumasetaat, pH = 9. It gradiëntprogramma wie as folget: 0–0,5 min, 2% B; 0,5–12 min, 2–50% B; 12–14 min, 50–98% B; 14–16 min, 98% B; 16–16,1 min, 98–2% B; 16,1–20 min, 2% B. De kolom waard op 40 °C hâlden en it stekproef op 10 °C yn 'e autosampler. De streamsnelheid wie 0,3 ml/min, it ynjeksjevolume wie 3 μl. In Q-Exactive Orbitrap massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mei in elektrospray-ionisaasje (ESI) boarne waard betsjinne yn folsleine scanmodus en keppele oan de ddMS2-monitormodus om grutte hoemannichten gegevens te sammeljen. De MS-parameters waarden as folget ynsteld: sprayspanning +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillêrtemperatuer 320 °C, beskermingsgas 40 arb, helpgas 10 arb, sondeferwaarmingstemperatuer 350 °C, scanberik 70–1050 m/o, resolúsje 70 000. Gegevens waarden sammele mei Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om de gegevenskwaliteit te beoardieljen, waarden poolde kwaliteitskontrôle (QC) samples generearre troch 10 μL aliquots fan 'e supernatant út elk sample te ferwiderjen. Seis ynjeksjes fan kwaliteitskontrôle samples waarden analysearre oan it begjin fan 'e analytyske sekwinsje om de stabiliteit fan it UPLC-MS-systeem te beoardieljen. Kwaliteitskontrôle samples wurde dan periodyk yn 'e batch ynfierd. Alle 11 batches fan serum samples yn dizze stúdzje waarden analysearre troch LC-MS. Aliquots fan in serum poolmingsel fan 100 sûne donors waarden brûkt as referinsjemateriaal yn respektive batches om it ekstraksjeproses te kontrolearjen en oan te passen foar batch-nei-batch effekten. Net-rjochte metabolomika-analyze fan 'e ûntdekkingskohort, ynterne falidaasjekohort en eksterne falidaasjekohort waard útfierd by it Metabolomics Center fan 'e Sun Yat-sen Universiteit. It eksterne laboratoarium fan it Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analysearre ek 40 samples fan 'e eksterne kohort om de prestaasjes fan it klassifikatormodel te testen.
Nei ekstraksje en rekonstitúsje waard de absolute kwantifikaasje fan serummetaboliten metten mei ultra-hege prestaasjes floeistofchromatografy-tandem massaspektrometry (Agilent 6495 triple quadrupole) mei in elektrospray-ionisaasje (ESI) boarne yn meardere reaksjemonitoring (MRM) modus. In ACQUITY BEH Amide kolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) waard brûkt om metaboliten te skieden. De mobile faze bestie út 90% (A) en 5% acetonitril (B) mei 10 mmol/L ammoniumacetaat en 0.1% ammoniakoplossing. It gradiëntprogramma wie as folget: 0–1.5 min, 0% B; 1.5–6.5 min, 0–15% B; 6.5–8 min, 15% B; 8–8.5 min, 15%–0% B; 8.5–11.5 min, 0% B. De kolom waard op 40 °C hâlden en it stekproef op 10 °C yn 'e autosampler. De streamsnelheid wie 0,3 mL/min en it ynjeksjevolume wie 1 μL. MS-parameters waarden as folget ynsteld: kapillêre spanning ±3,5 kV, verneveldruk 35 psi, skedegasstream 12 L/min, skedegastemperatuer 350 °C, droechgastemperatuer 250 °C, en droechgasstream 14 l/min. De MRM-konversaasjes fan tryptofaan, pyruvaat, laktaat, hypoxanthine en xanthine wiene respektivelik 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 en 151,0–107,9. Gegevens waarden sammele mei Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). Foar serummonsters waarden tryptofaan, pyruvaat, laktaat, hypoxanthine en xanthine kwantifisearre mei kalibraasjekurven fan standertmingseloplossingen. Foar selmonsters waard it tryptofaangehalte normalisearre nei de ynterne standert en selproteïnemassa.
Peak-ekstraksje (m/z en retinsjetiid (RT)) waard útfierd mei Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Om potinsjele ferskillen tusken batches te eliminearjen, waard elke karakteristike peak fan 'e testmonster dield troch de karakteristike peak fan it referinsjemateriaal út deselde batch om de relative oerfloed te krijen. De relative standertôfwikingen fan ynterne standerts foar en nei standerdisearring wurde werjûn yn Oanfoljende Tabel 6. Ferskillen tusken de twa groepen waarden karakterisearre troch falske ûntdekkingsrate (FDR <0,05, Wilcoxon signed rank test) en fold change (> 1,2 of <0,83). Rauwe MS-gegevens fan 'e ekstrahearre funksjes en referinsjeserum-korrizjearre MS-gegevens wurde werjûn yn Oanfoljende Gegevens 1 en Oanfoljende Gegevens 2, respektivelik. Peak-annotaasje waard útfierd op basis fan fjouwer definieare nivo's fan identifikaasje, ynklusyf identifisearre metaboliten, putatyf annotearre ferbiningen, putatyf karakterisearre ferbiningsklassen en ûnbekende ferbiningen 22. Op basis fan databasesykaksjes yn Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) waarden biologyske ferbiningen mei MS/MS-oerienkommende validearre standerts of krekte oerienkomstannotaasjes yn mzCloud (skoare > 85) of Chemspider úteinlik selektearre as tuskenprodukten tusken it differinsjaal metaboloom. Peakannotaasjes foar elke funksje binne opnommen yn Oanfoljende Gegevens 3. MetaboAnalyst 5.0 waard brûkt foar univariate analyze fan som-normalisearre metabolietoerfloed. MetaboAnalyst 5.0 evaluearre ek KEGG-paadferrikingsanalyze basearre op signifikant ferskillende metaboliten. Haadkomponintanalyze (PCA) en partielle minste kwadraten diskriminantanalyze (PLS-DA) waarden analysearre mei it ropls-softwarepakket (v.1.26.4) mei stacknormalisaasje en autoskalering. It optimale metabolietbiomarkermodel foar it foarsizzen fan nodule-maligniteit waard generearre mei binêre logistyske regresje mei minste absolute krimp en seleksjeoperator (LASSO, R-pakket v.4.1-3). De prestaasjes fan it diskriminantmodel yn 'e deteksje- en falidaasjesets waarden karakterisearre troch it skatten fan AUC op basis fan ROC-analyze neffens it pROC-pakket (v.1.18.0.). De optimale kânsôfsnijing waard krigen op basis fan 'e maksimale Youden-yndeks fan it model (gefoelichheid + spesifisiteit - 1). Samples mei wearden leger of heger as de drompel wurde foarsein as goedaardige nodules en longadenokarsinoom, respektivelik.
A549-sellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) waarden groeid yn F-12K medium mei 10% FBS. Koarte haarspeld-RNA (shRNA)-sekwinsjes dy't rjochte binne op SLC7A5 en in net-rjochte kontrôle (NC) waarden ynfoege yn 'e lentivirale fektor pLKO.1-puro. De antisense-sekwinsjes fan shSLC7A5 binne as folget: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Antistoffen tsjin SLC7A5 (#5347) en tubuline (#2148) waarden kocht fan Cell Signaling Technology. Antistoffen tsjin SLC7A5 en tubuline waarden brûkt yn in ferdunning fan 1:1000 foar Western blot-analyze.
De Seahorse XF Glykolytyske Stresstest mjit de nivo's fan ekstrasellulêre fersuring (ECAR). Yn 'e test waarden glukose, oligomycine A en 2-DG efterinoar administrearre om de sellulêre glykolytyske kapasiteit te testen lykas metten troch ECAR.
A549-sellen transfektearre mei net-rjochte kontrôle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) waarden oernachtich útplaat yn skûtels mei in diameter fan 10 sm. Selmetaboliten waarden ekstrahearre mei 1 ml iiskâlde 80% wetterige methanol. Sellen yn 'e methanoloplossing waarden ôfskraabd, sammele yn in nije buis en sintrifugearre by 15.000 × g foar 15 minuten by 4 °C. Sammelje 800 µl supernatant en droegje mei in hege-snelheid fakuümkonsentrator. De droege metabolietpellets waarden doe analysearre op tryptofaannivo's mei LC-MS/MS lykas hjirboppe beskreaun. Sellulêre NAD(H)-nivo's yn A549-sellen (NC en shSLC7A5) waarden metten mei in kwantitative NAD+/NADH kolorimetryske kit (#K337, BioVision) neffens de ynstruksjes fan 'e fabrikant. Proteïnenivo's waarden metten foar elk monster om de hoemannichte metaboliten te normalisearjen.
Der waarden gjin statistyske metoaden brûkt om de stekproefgrutte foarriedich te bepalen. Eardere metabolomika-stúdzjes rjochte op it ûntdekken fan biomarkers15,18 binne beskôge as benchmarks foar gruttebepaling, en yn ferliking mei dizze rapporten wie ús stekproef adekwaat. Gjin stekproeven waarden útsletten fan 'e stúdzjekohort. Serummonsters waarden willekeurich tawiisd oan in ûntdekkingsgroep (306 gefallen, 74,6%) en in ynterne falidaasjegroep (104 gefallen, 25,4%) foar net-rjochte metabolomika-stúdzjes. Wy hawwe ek willekeurich 70 gefallen selektearre út elke groep út 'e ûntdekkingsset foar rjochte metabolomika-stúdzjes. De ûndersikers wiene blyn foar groeptawizing tidens LC-MS-gegevensferzameling en -analyze. Statistyske analyses fan metabolomika-gegevens en seleksperiminten wurde beskreaun yn 'e respektive seksjes Resultaten, Figuerlegendes en Metoaden. Kwantifikaasje fan sellulêr tryptofaan, NADT en glykolytyske aktiviteit waard trije kear ûnôfhinklik útfierd mei identike resultaten.
Foar mear ynformaasje oer it stúdzjeûntwerp, sjoch de gearfetting fan it Natural Portfolio Report dy't by dit artikel heart.
De rûge MS-gegevens fan 'e ekstrahearre funksjes en de normalisearre MS-gegevens fan it referinsjeserum wurde werjûn yn Oanfoljende Gegevens 1 en Oanfoljende Gegevens 2, respektivelik. Peak-annotaasjes foar ferskillende funksjes wurde presintearre yn Oanfoljende Gegevens 3. De LUAD TCGA-dataset kin wurde downloade fan https://portal.gdc.cancer.gov/. De ynfiergegevens foar it plotten fan 'e grafyk wurde levere yn 'e boarnegegevens. Boarnegegevens wurde levere foar dit artikel.
Nasjonale Longscreeningstúdzjegroep, ensfh. Fermindering fan longkankersterfte mei lege-dosis kompjûtertomografy. Noard-Ingelân. J. Med. 365, 395–409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC Longkankerscreening mei lege-dosis helikale CT: resultaten fan 'e National Lung Screening Study (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al. Fermindering fan longkankersterfte mei volumetryske CT-screening yn in randomisearre proef. Noard-Ingelân. J. Med. 382, 503–513 (2020).
Pleatsingstiid: 18 septimber 2023