Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is in genoombewurkingstechnyk fan 'e tredde generaasje dy't de wrâld revolúsjonearre hat mei syn hege trochputresultaten. It is brûkt om ferskate biologyske sykten en ynfeksjes te behanneljen. Ferskate baktearjes en oare prokaryoten (lykas archaea) hawwe ek CRISPR/Cas9-systemen om har te ferdigenjen tsjin fagen. Der is rapportearre dat CRISPR/Cas9-basearre strategyen de groei en foarútgong fan triple negative boarstkanker (TNBC) kinne remme troch potinsjeel feroare resistinsjegenen, transkripsje en epigenetyske regeling te rjochtsjen. Dizze terapeutyske yntervinsjes kinne helpe by it oanpakken fan útdaagjende problemen lykas medisynresistinsje dy't sels yn TNBC waarnommen wurdt. Op it stuit wurde ferskate metoaden brûkt om CRISPR/Cas9 oan doelsellen te leverjen, lykas fysyk (mikroynjeksje, elektroporaasje en hydrodynamyske modi), firaal (adeno-assosjeare firus en lentivirus) en net-firaal (liposomen en lipide-nanopartikels). Hoewol ferskate modellen ûntwikkele binne om de molekulêre oarsaken fan TNBC te bestudearjen, beheint it gebrek oan gefoelige en rjochte metoaden foar it leverjen fan genoombewurkingsark yn vivo har klinyske tapassing. Gearfetsjend ûndersiket dizze resinsje wiidweidich de foarútgong, útdagings, beheiningen en perspektiven fan CRISPR/Cas9-behanneling foar TNBC op basis fan besteand bewiis. Wy markearje ek hoe't de kombinaasje fan keunstmjittige yntelliginsje en masinelearen CRISPR/Cas9-strategyen yn 'e behanneling fan TNBC kin ferbetterje.
Kanker wurdt karakterisearre troch ûnkontrolearre seldieling, fersteuring fan selsykluskontrôlepunten, en mutaasjes yn tumorsuppressorgenen (TSG's) (Matthews et al., 2022). Under de ferskate soarten kanker is boarstkanker it meast foarkommende type kanker by froulju en hat in hege mortaliteit wrâldwiid (Waks en Winer, 2019). Boarstkanker is in heterogene sykte mei ferskate skaaimerken, lykas histologyske en biologyske skaaimerken, klinyske presintaasje en gedrach, en reaksje op behanneling (Weigelt et al., 2010). Klassifikaasje fan boarstkanker jout presys ynsjoch foar boarstkankerdiagnoaze en tumorprognose. It gebrûk fan mienskiplike biomarkers en klinysk-patologyske skaaimerken is it wichtichste kritearium west foar de klassifikaasje fan boarstkanker (Tsang en Tse, 2019). De prognose en reaksje op behanneling fan boarstkanker wurdt beynfloede troch ferskate faktoaren, ynklusyf de oanwêzigens fan oestrogeenreseptor (ER), progesteronreseptor (PR), minsklike epidermale groeifaktorreseptor 2 (HER2/neu), en histologyske graad, tumortype en graad. grutte en lymfekliermetastase (Al-Tubaiti, 2020). Fiif yntrinsike molekulêre subtypen fan boarstkanker binne identifisearre, ynklusyf luminaal A, luminaal B, HER2-ferrike, basaal-achtich en claudine-leech (Prat et al., 2015). TNBC is in molekulêr subtype fan kanker dat net alle ER, PR en HER2 útdrukt (Yin et al., 2020). Dizze patologyske skaaimerken wurde assosjeare mei TNBC, wat de rappe foarútgong en agressiver aard befêstiget as elk oar type boarstkanker (Feng et al., 2018). Derneist brûkten Peru et al (2000) microarray-technology om boarstkanker opnij te klassifisearjen en fiif yntrinsike subtypen fan boarstkanker te identifisearjen (Cadenas, 2012). Basaal-achtige boarstkanker is in subtype fan boarstkanker dat in triple-negatyf fenotype hat en assosjeare wurdt mei rappe foarútgong. It moat opmurken wurde dat alle basaal-like boarstkankers faak ferkeard diagnostisearre wurde as TNBC, mar mar 77% binne TNBC; Yn tsjinstelling, 71-91% fan TNBC binne basaal-lik, wat oanjout dat dizze twa soarten boarstkanker oerlaapje en ferskillende klassifikaasjes fertsjintwurdigje (Wang D.-Y. et al., 2019). Dit skept in needsaak om de heterogeniteit fan TNBC te karakterisearjen om de prognose te ferdúdlikjen en potinsjele reaksjes op hjoeddeistige en takomstige behannelingen te identifisearjen. Derneist is TNBC ferantwurdlik foar 15-20% fan alle gefallen fan boarstkanker en komt faker foar by froulju ûnder de 50 jier. BRCA1- of BRCA2-mutaasjes binne rapportearre yn sawat 20% fan 'e TNBC-gefallen (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Undersyk hat ek oantoand dat TNBC in dúdlike ymmún-mikroomjouwing hat dy't hege nivo's fan vaskulêre endotheliale groeifaktoaren, tumor-assosjeare makrofagen (TAM's), tumor-infiltrearjende lymfocyten (TIL's) en oare molekulen omfettet dy't belutsen binne by tumorgroei en -migraasje. Dêrom is it begripen fan 'e mikroomjouwing fan TNBC krúsjaal foar de prognose en behanneling (Fan en He, 2022).
Om de prognose fan TNBC te beoardieljen en effektive behanneling te garandearjen, is in krekte diagnoaze, benammen basearre op immunohistochemy (IHC) om ER, PR en HER2 te detektearjen, en mammografy om boarstneoplasma's te detektearjen, wichtich. Mammografy kin lykwols gjin intratumorale skaaimerken lykas nekrose en fibrose adekwaat werjaan (Deepak Singh et al., 2021). Om't in minne prognose en diagnoaze dokters foarkomme om de juste medisinen foar te skriuwen (Chaudhary, 2020), wurde ferskate strategyen brûkt om de soarch foar pasjinten mei TNBC te ferbetterjen. Op it stuit wurde twa medisinen, doxorubicine en cyclophosphamide, brûkt by pasjinten mei TNBC en hawwe se goede resultaten sjen litten. Derneist wurde oare platina-medisinen brûkt, lykas carboplatine en cisplatine (Sikov et al., 2015). Derneist binne PARP-ynhibitoren lykas Olaparib, Velaparib en PF-01367338 brûkt as potinsjele gemoterapy-medisinen foar de behanneling fan TNBC (Ishino et al., 2018). Omdat rapportearre is dat Wnt/b-Catenin, NOTCH, en Hedgehog-sinjaalpaden belutsen binne by it foarkommen en de foarútgong fan TNBC, kin it rjochtsjen fan medisinen op dizze paden in wichtige strategy wêze (Aysola et al., 2013). Hoewol sjirurgy, strielingstherapy en gemoterapy hjoed de dei de wichtichste behanneling foar TNBC bliuwe, is wichtige foarútgong boekt yn 'e ûntwikkeling fan nije behannelingen, ynklusyf rjochte terapy, immunoterapy, ferskate CRISPR-relatearre genbewurkingsark lykas Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, prime editing, en CRISPR/Cas9-rjochte genterapy. Hjir sille wy ús rjochtsje op ferskate CRISPR-relatearre genbewurkingsark dy't brûkt wurde by de behanneling fan TNBC. Under harren hat CRISPR/Cas9 wiidferspraat omtinken krigen.
Cas9n, ek wol bekend as Cas9 nickase, is in genetysk manipulearre fariant fan it Cas9-protein ôflaat fan it CRISPR/Cas9 genoombewurkingssysteem (Gupta et al., 2019). Yn syn oarspronklike foarm befettet it Cas9-protein twa nukleasedomeinen: RuvC en HNH, wêrfan de wichtichste funksje it splitsen fan beide DNA-strengen is. Yn Cas9n is ien fan 'e nukleasedomeinen, HNH, lykwols genetysk mutearre en wurdt ynaktyf. Dêrom bliuwt it HNH-domein fan Cas9n net-funksjoneel. Allinnich it RuvC-domein bliuwt aktyf, wêrtroch Cas9n kin knippe of brekken meitsje op ienkele DNA-strengen (Trevino en Zhang, 2014). Yn ferliking mei Cas9 kin Cas9n off-target-effekten effektyf ferminderje en selreparaasjemeganismen sekuer ferbetterje. Cas9n kin brûkt wurde om ferskate problemen op te lossen, lykas it meitsjen fan brekken op spesifike lokaasjes yn dûbelstrengich DNA. Foar dit doel waarden twa Cas9n-molekulen kombineare en tegearre brûkt (Yee, 2016). Mixed lineage kinase 3 (MLK3) is in mitogen-aktivearre proteïnekinase dy't tsjinnet as in wichtige regulator tidens TNBC-metastase (Cronan et al., 2012).
MLK3 kin meardere sinjaalpaden aktivearje dy't liede ta TNBC-metastase. Bygelyks, it c-Jun N-terminale kinase (JNK) paad regelet selmotiliteit en ekstrasellulêre matrixdegradaasje, en MLK3 aktivearret it JNK-paad, wêrtroch't selmotiliteit ferbettere wurdt en invasive eigenskippen krigen wurde (Rattanasinchai en Gallo, 2016). MLK3 regelet ek EMT. Om dit te dwaan, aktivearret it downstream transkripsjefaktoaren lykas Snail, Slug en Twist. Dizze faktoaren remme de ekspresje fan epitheliale markers en befoarderje de ekspresje fan mesenchymale markers, wat liedt ta de oanwinst fan in metastatysk fenotype (Casalino et al., 2023). MLK3 is waarnommen om in rol te spyljen yn ECM-remodellering en aktivearring fan proteasen lykas matrixmetalloproteinasen (MMP's) dy't it ECM ôfbrekke. Dit fasilitearret tumorselynvaazje en fersprieding nei fierdere plakken (Katari et al., 2019). Sa hawwe eardere stúdzjes oantoand dat MLK3 in krityske rol spilet yn TNBC. Rattanasinchai en Gallo brûkten TNBC-modellen om de rol fan MLK3 te bestudearjen en fûnen dat it kankerûntwikkeling befoarderet fia spesifike sinjaalpaden. Se brûkten CRISPR/Cas9n om MLK3 te bewurkjen en observearren in wichtige fermindering fan TNBC-metastase (Rattanasinchai en Gallo, 2016).
dCas9, faak ynaktyf Cas9 neamd, is in modifisearre derivative foarm fan it Cas9-protein. Oars as aktyf Cas9, mist dCas9 endonuklease-aktiviteit, wêrtroch't it gjin DNA-dûbelstringbrekken kin feroarsaakje. Dêrom kin dCas9 brûkt wurde om presys spesifike regio's fan it genoom te rjochtsjen sûnder feroarings of modifikaasjes oan 'e DNA-sekwinsje (Wang et al., 2016). Yn dCas9 wurde twa endonuklease-proteinen, RuvC en HNH, ynaktivearre troch wichtige aminosoerresiduen te ûnderdrukken. (Richter et al., 2016). Nettsjinsteande it gebrek oan DNA-splitsingsaktiviteit spilet dCas9 in oantal wichtige rollen yn genetysk ûndersyk en biotechnology. Bygelyks, it makket fisualisaasje fan spesifike regio's fan it genoom mooglik, fasilitearret transkripsjonele regeling en befoarderet epigenetyske modifikaasjes (Brocken et al., 2018).
De transkripsjefaktor ZEB1 (zinkfinger E-box binding homeobox 1) spilet in spesifike en krityske rol yn it bemiddeljen fan epitheliaal-mesenchymale oergong (EMT), in sellulêr proses dat foarkomt tidens embryonale ûntwikkeling, weefselreparaasje en kankerprogresje. It giet om de transformaasje fan epitheelzellen yn mesenchymale sellen, wat resulteart yn feroaringen yn selmorfology, motiliteit, invasiviteit, ensfh. (Wu et al., 2020). ZEB1 remt meardere epitheelmarkers, lykas E-cadherin en Occludin, dy't ferantwurdlik binne foar it behâld fan sel-sel-adhesion en polariteit fan epitheelzellen yn TNBC (Moreno-Bueno et al., 2008). Derneist aktivearret ZEB1 bepaalde markers lykas N-cadherin, vimentin en fibronektin (Konradi et al., 2014) en regelt ek genen dy't belutsen binne by cytoskeletale remodeling lykas Rho GTPases en matrixmetalloproteinases (MMP's) (Huang). et al., 2014). 2022), derneist beynfloedet it ek ferskate sinjaalpaden lykas transformerende groeifaktor-β (TGF-β), Wnt-sinjalearring, ensfh., wêrtroch tumorynvaazje en metastase yn TNBC befoardere wurdt (Chen et al., 2016). Tal fan stúdzjes en wittenskiplik bewiis jouwe oan dat ZEB1 in grut potinsjeel hat as in weardefol middel foar it opspoaren en terapeutyske yntervinsje fan TNBC. Yn in resinte stúdzje brûkten Waryah et al. in TNBC-model en berikten se folsleine ûnderdrukking fan ZEB1 troch dCas9. Sa observearren se in tige hege spesifisiteit en hast folsleine ynhibysje fan ZEB1 ûnder in vivo-omstannichheden (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 is in genbewurkingsark mei de namme CRISPR/Cpf1. It is ôflaat fan it CRISPR/Cas-systeem, wêrby't de term Cas12 ferwiist nei CRISPR-assosjeare proteïne 12 (Bharathkumar et al., 2022), dat folslein fergelykber is mei Cas9. It ienige ferskil is dat it it Cas12-proteïne befettet. Yn ferliking mei Cas9 hat Cas12 wat unike funksjes lykas it generearjen fan kleverige einen tidens it genbewurkingsproses, wylst Cas9 stompe einen genereart (Wang et al., 2021). Dizze eigenskip fan Cas12 draacht by oan syn spesifike DNA-manipulaasjetechnology. As in proteïne dy't by steat is om doel-DNA presys te werkennen en te snijen, hat it bûtengewoane alsidichheid, wêrtroch it in effektyf ark is foar in ferskaat oan tapassingen, ynklusyf genbewurking (Pickar-Oliver en Gersbach, 2019).
Lykas oare CRISPR-farianten is CRISPR/Cas12 ek yn steat om genen yn TNBC út te skeakeljen of te aktivearjen, rjochte op genen dy't in wichtige rol spylje yn syn patogenese of reaksje op behanneling (Yang en Zhang, 2023). Om dit proses te berikken, is in gids-RNA (gRNA) ûntwikkele dat Cas12 nei it doelgen rjochtet. Sadree't Cas12 oan syn doelwit bindt, yntrodusearret it dûbelstringbrekken yn DNA en aktivearret DNA-reparaasjemeganismen. Tidens it reparaasjeproses kinne ferkearde nukleotiden wurde opnommen, wat liedt ta genmutaasjes en ferlies fan funksje (Zhang et al., 2021a). Derneist waard ek in ferbettere ferzje fan it Cas12-enzym (neamd dCas12) brûkt om genen te aktivearjen. Troch it te kombinearjen mei in transkripsjeaktivator is it mooglik om bepaalde genen te indusearjen, wêrtroch't se aktivearre wurde. Dizze technology hat in grut potinsjeel yn it befoarderjen fan de aktivearring fan tumorsuppressorgenen (Sultan et al., 2022).
Prime editing is in nij ûntwikkele en ekstreem superieure genoombewurkingstechnology. It is by steat om it DNA fan in organisme tige presys te modifisearjen (Chen en Liu, 2023). Prime editing wurdt berikt troch de yntegraasje fan twa haadkomponinten: in modifisearre CRISPR/Cas9-enzym en reverse transkriptase. De rol fan it CRISPR/Cas9-enzym is om selektyf krekte plakken yn it genoom te rjochtsjen, wylst reverse transkriptase helpt om it DNA op 'e doellokaasje yngeand te modifisearjen (Hassan et al., 2021). Yn it primerbewurkingsmeganisme omfettet de earste stap it meitsjen fan in primerbewurkingsgids-RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021). It befettet de doelsekwinsje en RNA-sjabloan dy't oerienkomme mei de winske bewurkingsplak yn it doel-DNA. It pegRNA wurdt dan ynfierd yn doelsellen tegearre mei in primerbewurkingsnuklease (PE2). PE2 is in fúzjeproteïne besteande út in Cas9-enzym, in reverse transkriptase en in primerbewurkingsadapter (Martín-Alonso et al., 2021). Binnen de sel sykje pegRNA- en PE2-kompleksen nei it spesifike DNA dat se oanpasse wolle. It Cas9-enzyme snijt DNA en makket in sjabloan besteande út ienkele strengen (Choi et al., 2022). Reverse transcriptase brûkt dit sjabloan om it DNA ta te rieden op bewurking. Neist it kopiearjen fan DNA binne ek ynstruksjes foar it bewurkjen fan it RNA-sjabloan opnommen. Uteinlik wurdt de nij oanmakke DNA-string brûkt as in sjabloan om de breuk yn it DNA te reparearjen, wat resulteart yn in feroare DNA-sekwinsje dy't de winske modifikaasje befettet (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Primer-bewurkingsmeganismen kinne liede ta wiidfersprate mutaasjes yn genen. It kin rjochte wêze op puntmutaasjes, ynfoegings, wiskingen en sels genferfangingen (Anzalone et al., 2019; Chen en Liu, 2023). Prime-bewurking biedt ferskate foardielen boppe eardere genoombewurkingstechnologyen. Dizze omfetsje ferhege krektens, fermindere off-target-effekten en de mooglikheid om DNA te bewurkjen sûnder te fertrouwen op DNA-dûbelstringbrekken (Anzalone et al., 2020).
CRISPR/Cas9-technology waard oarspronklik ûntwikkele om baktearjes te beskermjen tsjin plasmide-oerdracht en faaginfeksje en waard letter opnij brûkt as in effektyf RNA-basearre DNA-targeting-ark foar genoombewurking (Jiang en Doudna, 2017). Derneist is rapportearre dat it CRISPR/Cas9-systeem oanwêzich is yn respektivelik 50% en 87% fan baktearjele en archaeale genomen (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 is in potinsjeel ark foar it wiskjen, ynfoegjen en korrigearjen fan elke abnormale genetyske sekwinsje mei help fan in vivo- en in vitro-modi (Sabit et al., 2021). Boppedat is oantoand dat CRISPR/Cas9 diel útmakket fan it adaptive ymmúnsysteem fanwegen syn spesifisiteit foar doelgenen fan belang (Chen en Zhang, 2018).
CRISPR/Cas9 bestiet út Cas9 en in inkele gids-RNA (sgRNA). Cas9 is in endonuklease gearstald út meardere proteïnekomponinten. Derneist hat Cas9 unike strukturele en konformaasje-eigenskippen (Pacesa et al., 2022), om't it bestiet út twa lobben: erkenning (REC) en nuklease (NUC). De REC-lob is fierder ferdield yn trije regio's: REC1, REC2, en brêgeheliksen (Cromwell et al., 2018). De NUC bestiet út trije lobben, nammentlik RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH en it ynteraksjedomein fan it protospacer adjacent motif (PAM) (Fig. 1) (Song et al., 2016). sgRNA bestiet út twa komponinten, ynklusyf CRISPR RNA (crRNA) en transkodearjend lyts RNA (tracer RNA) (Figuer 1). It sgRNA ferbynt it Cas9-proteïne mei connexinen om in aktyf kompleks te foarmjen, ek wol bekend as it effektorkompleks (Richter et al., 2012). crRNA is in basispear fan 18–20 nukleotiden dat in krityske rol spilet by it werkennen fan doel-DNA-sekwinsjes. Derneist pearret crRNA mei it doel-DNA, en tracrRNA fungearret as in steiger foar de Cas9-nuklease om it doel-DNA te binen (Manghwar et al., 2019). Oan 'e oare kant hat de PAM-sekwinsje 3 nukleotiden, wat de binding fan it effektorkompleks oan DNA befêstiget, spesifisearret en bemiddelet. De Cas9-proteïnekompleks-subeenheden RuvC en HNH hawwe katalytyske aktiviteit (Richter et al., 2012; Asmamaw en Zawdie, 2021). It HNH-nukleasedomein fan 'e Cas9-subeenheid splitst de DNA-string dy't assosjeare is mei it crRNA. It RuvC-nukleasedomein klieft oare DNA-strengen en genereart dûbelstrengsbrekken (DSB's), wêrnei't twa ferskillende DNA-brekkenreparaasjemeganismen aktivearre wurde (Jiang en Doudna, 2017) (Ofbylding 1).
Figuer 1. Oersjoch fan CRISPR/Cas9 (A). Komponinten fan it CRISPR/Cas9-systeem: (i). Cas9-endonuklease is ferantwurdlik foar it knippen fan 'e doel-DNA-sekwinsje, (ii) in inkele gids (sg) RNA dy't ûntstiet út 'e fúzje fan crRNA en tra-crRNA-chimera's. (twa). Cas9 omfettet ferskate komponinten lykas Rec I, Rec II, NUC-lob (HNH en Ruv C binne subkomponinten) en PAM-ynteraksjedomein (C) mei oerienkommende funksjes. It CRISPR/Cas9-proteïnekompleks splitst DNA-sekwinsjes yn net-komplementêre en komplementêre foarmen (D). CRISPR/Cas9 bewurket it genoom yn trije stadia: erkenning, knippen en reparaasje. It ûntworpen sg-RNA begeliedt Cas9 en herkent de winske sekwinsje fia de komplementêre komponint crRNA. Cas9 herkent de PAM-sekwinsje op 5′-NGG-3′ en smelt it DNA, wêrtroch in DNA-RNA-hybride ûntstiet en de splitsing aktivearre wurdt. It HNH-domein fan Cas9 splitst de komplementêre string, en it RuvC-domein splitst de net-komplementêre string. CRISPR/Cas9 reparearret dsDNA troch it op twa manieren te brekken: net-homolooch einferbining (NHEJ) en homology-rjochte reparaasje (HDR). NHEJ reparearret dûbelstringich DNA yn 'e ôfwêzigens fan frjemd homolooch DNA fia in enzymatysk proses, in flatergefoelich meganisme dat willekeurige DNA-sekwinsjes ynfoegje of fuortsmite kin. HDR is tige spesifyk en fereasket homologe DNA-sjabloanen.
CRISPR/Cas9-mediearre reparaasjepaden omfetsje net-homolooch einferbinen (NHEJ) en homology-rjochte reparaasje (HDR) meganismen. NHEJ is in paad gefoelich foar flaters, om't it ynfoegjen of wiskjen omfettet en gjin patroan fereasket tidens it reparaasjemeganisme. It brûkt willekeurige nukleotiden om standertproteinen te generearjen (Abbasi et al., 2021). Dit reparaasjesysteem bestiet út fjouwer kompleksen lykas it KU-kompleks, it krúskomplementearjende proteinkompleks type 4 (XRCC-4), it DNA-einferwurkingsenzym, en de proteinkinase DNA-PKcs (Abbasi et al., 2021). It KU-kompleksprotein hat twa sub-ienheden, Ku 70 en Ku 80, en spilet in wichtige rol yn it NHEJ-meganisme, om't it reparaasjemeganisme wurdt inisjearre troch de binding fan twa sub-ienheden (Ku 70 en Ku 80) oan 'e stompe of hast stompe einen fan it doel-DNA (Abbasi et al., 2021), en tsjinnet as in steiger om oare NHEJ-relatearre faktoaren te rekrutearjen nei it plak fan ferwûning (Yang et al., 2020). XRCC-4 en DNA-ligase binne gearstald út respektivelik 334 en 911 aminosoeren, en it XRCC4-DNA-ligase IV-kompleks stimulearret ligaasje fan DNA-einen (Chatterjee et al., 2015). DNA-einferwurkingsenzym, ek wol bekend as polynukleotide kinase 3'-fosfaat, is in DNA-einferwurkingsenzym. It kin de 3'P-groep yn DNA fuortsmite en de 5'OH-groep fosforylearje tidens DSB-reparaasje. It giet ek om it reparearjen fan single-strand breaks (SSB's) mei it SSB-reparaasjepaad (Chatterjee et al., 2015). Proteïnekinase DNA-PKcs is in DNA-ôfhinklike proteïnekinase dy't bestiet út in katalytyske subeenheid fan 'e PIKK's (fosfatidylinositol 3-kinase-relatearre kinasen) en ataxia telangiectasia mutated (ATM) famylje, lykas ATM- en Rad3-relatearre ATR's, strand breaks (DSB's) en single-strand breaks (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR is in krekter en geskikter reparaasjemeganisme, om't de ynformaasje kopiearre wurdt mei de yntakte foarm fan 'e homologe DNA-duplex, hoewol it de oanwêzigens fan susterchromatiden fereasket. Dit bart tidens de S/G2-faze fan 'e selsyklus fan sûchdieren. HDR komt benammen foar yn gistsoarten, mar NHEJ is kritysk yn sûchdieren (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). It folsleine reparaasjemeganisme wurdt werjûn yn figuer 1.
Omdat TNBC feroarsake wurdt troch genetyske en epigenetyske abnormaliteiten, kin korreksje fan maligne genomyske/epigenomyske abnormaliteiten mei CRISPR/Cas9 in ridlike terapeutyske oanpak wêze (Chen et al., 2019). Derneist kinne guon transkripsjefaktoaren dy't belutsen binne by selspesifike transkripsjonele regeling unike skaaimerken fan kankersellen sjen litte, wat suggerearret dat transkripsjonele regeling in poerbêste oanpak kin wêze foar kankerbehanneling (Drost et al., 2017). It eksploitearjen fan dizze molekulêre skaaimerken fan tumors, lykas genetyske, epigenetyske en transkripsjonele defekten, foar medisynûntwikkeling kin klinyske útkomsten ferbetterje en screeningskosten ferminderje. CRISPR is in potinsjele genbewurkingstool dy't net allinich kankerferoarsaakjende genomyske doelen kin detektearje en identifisearje, mar ek brûkt wurde kin om onkogenen yn minsklike sellen te bewurkjen, te ûnderdrukken en epigenetysk te modifisearjen (Tabel 1) (Ahmed et al., 2021). Ferskate CRISPR-screens binne útfierd om te sykjen nei genen dy't ferbûn binne mei tumorsuppressoren, onkogenen en medisynresistinsje. It gebrûk fan CRISPR/Cas9 om ferskate TNBC-onkogenen te bewurkjen wurdt werjûn yn figuer 2.
Figuer 2. Genbewurking fan ferskate TNBC-onkogenen mei CRISPR/Cas9, wat resulteart yn fermindere tumorgroei en metastase. Dizze onkogenen omfetsje CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 en CXCR7, Crypto1, ROR1 en ST8SIA, dy't belutsen binne by it foarkommen en de metastase fan TNBC.
Kankerselsmigraasje, ynvaazje en epitheliaal-mesenchymale oergong (EMT) binne assosjeare mei ITGA9. Eardere stúdzjes hawwe oantoand dat ITGA9 in wichtige spiler is yn it Notch-paad en in nijsgjirrige rol spilet yn rhabdomyosarkoommetastase (Molist et al., 2020). Derneist waard fûn dat ITGA9 nau assosjeare is mei de prognose fan pasjinten yn ferskate tumortypen, ynklusyf boarstkanker (Wang Z. et al., 2019). Derneist liet bioinformatyske analyze fan ITGA9 sjen dat de ekspresje yn TNBC signifikant heger wie as yn oare boarstkankersubtypen. Ferhege ITGA9-nivo's binne assosjeare mei tumormetastase en weromfal by TNBC-pasjinten. Knockout fan ITGA9 troch CRISPR/Cas9 resultearre yn kankerstamsel (CSC)-achtige eigenskippen, tumorangiogenese, tumorgroei en fermindere metastase troch it befoarderjen fan β-catenine-degradaasje yn TNBC (Wang Z. et al., 2019).
Krypto-1 is in lid fan 'e TGF-β-famylje en is kritysk foar iere embryogenese, ûnderhâld fan stamsellen en kankermetastase (Ishii et al., 2021). Ek wol bekend as Tdgf-1, is it in onkogene GPI-ferankere sinjalearingsproteïne dy't belutsen is by de regeling fan 'e foarming fan 'e primitive streak, mesoderm en endoderm, lykas by it fêstigjen fan lofts/rjochts asymmetry yn 'e ûntwikkeling fan lichemsorganen tidens embryogenese (Zhang et al., 2021b). Derneist is oantoand dat Cripto-1 belutsen is by epitheliaal-mesenchymale oergong (EMT) as in stamselmarker (Zhang et al., 2021b). EMT is kritysk, net allinich foar ferskate prosessen lykas embryonale ûntwikkeling, fibrose en wûnegenêzing, mar ek foar kankerynvaazje en metastase. Derneist is oantoand dat Cripto-1 ynteraksje hat mei fjouwer Notch-receptors en har post-translasjonele ryping ferbetteret (Brandstadter en Maillard, 2019). It is bekend dat de Notch-sinjalearingsrûte belutsen is by it ûnderhâld fan minsklike boarstkankersellen. Undersyk hat oantoand dat CRISPR/Cas9-mediearre knockout fan Crypto-1 kankergroei en metastase ûnderdrukt. Dêrom kin Crypto-1 in wichtich terapeutysk doelwyt wurde foar TNBC (Castro et al., 2015).
XCL12-proteïne en syn chemokine-reseptor CXC (CXCR4 en CXCR7) spylje ferskate rollen yn kankerselproliferaasje, groei, migraasje en ynvaazje (Wu et al., 2015). Dizze chemoreseptoren binne assosjeare mei de ûntwikkeling fan TNBC fia meardere sinjaalpaden yn sawol in vivo as in vitro-modellen (Wu et al., 2015). Derneist wurdt aktivearring fan CXCR4 en CXCR7 assosjeare mei gruttere gefoelichheid foar metastase en in minne prognose yn TNBC (Karn et al., 2022). Dêrom kin knockout fan CXCR4 en CXCR7 effektive medisyndoelgenen wurde foar de behanneling fan boarstkanker, ynklusyf TNBC. Stúdzje troch Yang et al. Yang et al (2019) brûkten CRISPR/Cas9 om de CXCR4- en CXCR7-genen mei-inoar út te skeakeljen en fûnen dat TNBC-proliferaasje, groei, migraasje en ynvaazje signifikant waarden ynhibearre (Yang et al., 2019).
Ferhege nivo's fan miR-3662, in TNBC-onkogene, waarden waarnommen yn boarstkankerweefsels (Yi et al., 2022). It is oantoand dat it delheljen fan miR-3662 de groei en metastase fan boarstkankertumoren remt, sawol yn vivo as yn vitro (Agarwal en Gupta, 2021). HBP-1 is in krêftige remmer fan Wnt/-catenine-sinjalearring en is wierskynlik ferantwurdlik foar miR-3662-bemiddelde groei fan TNBC-sellen. Koartlyn hawwe Yi et al. fûn dat de miR-3662-HBP1-as it Wnt/-catenine-sinjalearingspaad yn TNBC-sellen regelet (Yi et al., 2022). Fanwegen syn tumorspesifike ekspresje kin miR-3662 in potinsjeel terapeutysk doelwyt wêze foar TNBC. Dêrom kin it delheljen fan miR-3662 troch CRISPR/Cas9 in poerbêste oanpak wêze foar it ûntwikkeljen fan nije medisinen foar de behanneling fan TNBC.
UBR5 is in 300 kDa nukleofosfoproteïne dat identifisearre is as in wichtige regulator fan tumorigenese, metastase en ymmúnreaksje yn ferskate kankers (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Der is rapportearre dat UBR5 tige opregulearre is yn TNBC-samples en stimulearret de ERα-funksje troch proliferaasje te indusearjen fia syn ubiquitineligase-aktiviteit (Bolt et al., 2015). Stúdzjes mei folsleine eksoomsekwinsjearring fan primêre TNBC-samples lieten ek ferhege ekspresje fan UBR5 sjen, wat suggerearret dat it in rol spilet yn 'e ûntwikkeling fan TNBC. Derneist liet CRISPR/Cas9-oandreaune deleasje fan UBR5 wichtige ynhibysje fan TNBC-metastase en groei sjen yn eksperimintele mûsmodellen. Boppedat herstelde de opname fan UBR5 yn in wildtype mûsmodel syn folsleine funksjonaliteit, wylst dit effekt net waarnommen waard yn ynaktivearre mutantstammen (Liao et al., 2017). Gebrek oan UBR5 wurdt assosjeare mei ferhege apoptose, nekrose en ynhibysje fan tumorgroei yn TNBC fanwegen minne angiogenese. Troch it ferlies fan UBR5 wurdt tumorfersprieding nei fierdere organen fermindere, en UBR5 feroarsaket abnormale EMT benammen troch E-cadherin-ekspresje te ferminderjen (Zhang en Weinberg, 2018). Koartlyn waard oantoand dat UBR5 in heul wichtige faktor is yn IFN-γ-induzearre PDL1-transkripsje yn TNBC fanwegen syn gebrek oan E3 ubiquitinaasje-aktiviteit. RNA-transkriptoomanalyse liet sjen dat UBR5 systemyske effekten kin hawwe op genen dy't ferbûn binne mei it IFN-γ-paad en PDL1-transaktivaasje befoarderje troch it ferheegjen fan aktivearringsnivo's fan proteïnekinase RNA (PKR) en syn sinjaaltransducers en aktivators. transkripsje 1 (STAT1) en interferon-regulearjende faktor 1 (IRF1). CRISPR/Cas9-bemiddelde kombineare ablaasje fan UBR5- en PD-L1-ekspresje hat lykwols in synergistysk terapeutysk effekt as beide blokkades allinich, mei djipgeande effekten op 'e tumor-mikroomjouwing (Wu et al., 2022). Dêrom kin CRISPR/Cas9 in wichtich ark wêze om de UBR5-funksje te remmen, wêrtroch TNBC-metastase en tumorgroei ûnderdrukt wurde.
ROR1 is in type I transmembraanproteïne dat útdrukt wurdt tidens kanker en embryonale ûntwikkeling en is identifisearre as in onkofetaal proteïne (Nicholas Borcherding, 2014). It invasive gedrach fan ferskate minsklike kankers wurdt assosjeare mei opregulearring fan ROR1. Taseine resultaten binne krigen út in vivo- en in vitro-stúdzjes mei terapeutyske ferbiningen dy't rjochte binne op ROR1 (Chien et al., 2016). Ferhege nivo's fan ROR1 mRNA yn boarstweefselbiopsies binne ek assosjeare mei agressive basaal-like boarsttumors (BL) en har migraasje nei oare dielen fan it lichem. Boppedat is oerekspresje fan ROR1 identifisearre as in prognostische marker foar de ûntwikkeling fan TNBC (Chien et al., 2016). It stilmeitsjen fan ROR1 mei CRISPR/Cas9 om TNBC-groei en metastase te ûnderdrukken soe lykwols in effektive strategy wêze.
It sialylaasjeproses omfettet de tafoeging fan siaalsoer oan glykokonjugaten, wat katalysearre wurdt troch sialyltransferasen (ST's). ST8SIA1 heart ta de ST-famylje en spilet in wichtige rol yn 'e patogenese fan ferskate sykten lykas lymfocytyske leukemy en kolorektale kanker (Chang et al., 2018). RNA-sekwinsje-analyze lit sjen dat ST8SIA1 heech útdrukt wurdt yn boarstweefsel fan TNBC-pasjinten en posityf korrelearre is mei mutaasjes yn it tumorsuppressorgen p53, wat kin bydrage oan 'e patogenese fan TNBC (Battula et al., 2017). Derneist is ST8SIA1 belutsen by de metastase en weromkommen fan TNBC, wat suggerearret dat it in wichtige rol spilet yn it foarkommen en de ûntwikkeling fan TNBC. Yn in in vitro-model fan TNBC waard oantoand dat knockdown fan ST8SIA1 troch CRIPSR/Cas9 groei en metastase blokkearret (Battula et al., 2017). Dit suggerearret dat CRISPR/Cas9 in wichtich ark wêze kin foar it remmen fan 'e funksje fan it ST8SIA1-onkogen yn 'e behanneling fan TNBC.
NAT1 is in metabolysk enzyme dat de foarming fan faze II xenobiotyske ferbiningen katalysearret en wurdt útdrukt yn hast alle minsklike weefsels. NAT1 kin de kofaktor folaat brûke om acetyl-CoA (acetyl-CoA) te rjochtsjen, sels yn 'e ôfwêzigens fan it aromaatyske aminesubstraat (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Undersyk hat oantoand dat NAT1 de funksje fan matrix metalloproteinase 9 (MMP9) regulearret yn boarstkankerselmodellen en beskermet tsjin reaktive soerstofsoarten (ROS) tidens glukosehonger (Wang et al., 2018). Ferwidering fan NAT1 is oantoand om it pyruvaatdehydrogenasekompleks te remjen, wat liedt ta mitochondriale dysfunksje (Wang L. et al., 2019). Derneist hawwe ferskate oare rapporten oantoand dat NAT1-ynhibysje mei lytse molekulen en siRNA-stilmeitsjen de ynvasiviteit en proliferaasje fan boarstkankersellen kin ferminderje (Stepp et al., 2018). Koartlyn waard CRISPR/Cas9 brûkt om NAT1 te ûnderdrukken yn 'e boarstkankerselline MDA-MB-231, wat ynfloed hat op sellulêr metabolisme ôfhinklik fan it ekspresjenivo. Dizze stúdzje liet ek sjen dat NAT-1 kritysk is foar de foarútgong en metastase fan TNBC (Carlisle et al., 2020).
Koördinearre transkripsje fan onkogenen wurdt regele troch superfersterkers, transkripsjefaktoaren en kofaktoren (Hnisz et al., 2015). Derneist binne in groep cycline-ôfhinklike kinasen (CDK's), lykas CDK7, CDK8, CDK9, CDK12, en CDK13, nedich foar transkripsjonele regeling. Under harren is CDK7 belutsen by de fosforylaasje fan RNA-polymerase II, wat tige wichtich is foar it begjin en de útwreiding fan onkogenetranskripsje yn 'e patogenese fan TNBC. Yn in wichtige stúdzje remde ferwidering fan CDK7 troch CRISPR/Cas9 TNBC, wat oanjout dat de patogenese fan TNBC CDK7-ôfhinklik is (Wang Y. et al., 2015).
Undersyk hat oantoand dat mutaasjes yn MYC en RBP (RNA-binende proteïne) kinne liede ta apoptose, wylst ienkele genmutaasjes yn MYC of RBP gjin ynfloed hawwe op 'e groei fan kankersellen (Einstein et al., 2021). Mear as 1000 RBP's yn it minsklik genoom binne screene mei in CRISPR/Cas9-basearre bibleteek. Dêrûnder waarden 57 RBP's kritysk fûn foar de groei fan kankersellen mei heech ferhege MYC-nivo's (Wheeler et al., 2020). Derneist is YTHDF2 wichtich foar it behâld fan TNBC-selgroei en ferminderet de hoemannichte methylearre transkripten tidens transkripsje en oersetting op heech nivo yn kankersellen mei hegere MYC-ekspresje. Derneist is YTHDF2 net essensjeel foar kankersellen, dy't minder ôfhinklik binne fan ferhege MYC-nivo's om it oerlibjen fan TNBC-pasjinten te ferlingjen (Einstein et al., 2021), wat suggerearret dat it in potinsjeel terapeutysk doelwyt kin wêze foar medisinen dy't TNBC kinne oerwinne.
Sinkfingerproteinen (ZNF's) meitsje sawat 1% út fan it totale minsklike genoom. Undersyk hat oantoand dat ZNF selproliferaasje kin regelje yn ferskate kankersoarten, lykas leverkanker, boarstkanker en kolorektale kanker (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Biblioteken generearre troch CRISPR-knockout binne brûkt om ferskate tumorsuppressorgenen (TSG's) yn boarstkankersellen te screenen (Shalem et al., 2014). Sûnt dy tiid hat in transkriptomyske stúdzje fan CRISPR/Cas9 ZNF319-deletearre boarstkankersellen oantoand dat ZNF319 in tumorsuppressorgen is dat boarstkankerproliferaasje ferminderet en dêrom belutsen is by ferskate potinsjele sinjaalmeganismen en oare biologyske funksjes (Wang L. et al., 2022).
Ferroptose is in soarte fan programmearre seldea dy't ôfhinklik is fan 'e oanwêzigens fan izer. It is bekend dat de ûntwikkeling fan ferroptose beynfloede wurdt troch de oanwêzigens fan lipideperoksiden. Derneist is rapportearre dat PKCβII iere lipideperoksidaasje fertoant, en ferhege lipideperoksidaasje is assosjeare mei ferroptose. Screening fan in bibleteek fan CRISPR/Cas9-mediearre kinase-ynhibitoren liet sjen dat PKCβII belutsen is by it proses fan lipideperoksidaasje, wat kritysk is foar ferroptose yn MDA-MB-231-sellen (Zhang et al., 2022). Dêrom suggerearret dit dat knockout fan PKCβII troch CRISPR/Cas9 in potinsjeel tumorsuppressorgendoel kin wêze foar de behanneling fan ferroptose-relatearre sykten (Zhang et al., 2022).
Der wurdt tocht dat medisynresistinsje ferantwurdlik is foar sawat 90% fan 'e deaden by kankerpasjinten en is ien fan 'e grutste útdagings yn kankerbehanneling (Bukowski et al., 2020). De resultaten jouwe oan dat in foldwaande oantal genen dy't relatearre binne oan medisyn-efflux, DNA-reparaasje, apoptose en ferskate selsignalisaasjepaden assosjeare binne mei medisynresistinsje (Haider et al., 2020). Under harren binne ferskate genen rjochte op CRISPR/Cas9-ark en hawwe se beloftefolle resultaten sjen litten yn it ferminderjen fan medisynresistinsje en it fergrutsjen fan 'e effektiviteit fan anty-kankerbehannelingen (Vaghari-Tabari et al., 2022). Derneist binne CRISPR/Cas9-gen-knockout-screeningbibleteken mei hege trochfier ymplisearre by it oanpassen fan 'e funksje fan potinsjele doelen foar medisynresistinsjegenen (Shalem et al., 2015). Om paclitaxel-resistinsjegenen te identifisearjen, waard RNA-sekwinsje keppele oan genoomwide sgRNA-bibleteekscreening brûkt om acht kandidaatgenen te identifisearjen, ynklusyf histondeacetylase 9 (HDAC9), dy't assosjeare binne mei medisynresistinsje by pasjinten mei weromkommende TNBC (B et al., 2020). Yn in oare stúdzje waard ferhege ekspresje fan diserine/threonine en tyrosine-proteïnekinase (DSTYK) waarnommen tidens it oerlibjen fan TNBC-pasjinten behannele mei antikankermiddels. Boppedat fersterke CRISPR/Cas9-mediearre knockdown fan DSTYK de apoptose fan medisynresistinte kankersellen signifikant yn vitro (SUM102PT-sellen en MDA-MB-468-sellen) en in in vivo TNBC-model (Ogbu et al., 2021).
Hoewol TNBC abnormale aktivearring fan 'e MAPK-paad hat, is it klinyske effekt fan MEK-rjochte terapyen min. In CRISPR/Cas9 genomyske bibleteekscreening die bliken dat ynhibysje fan PSMG2 (proteoomassemblage chaperone 2) TNBC BT549- en MB468-sellen gefoelich makket foar de MEK-remmer AZD6244. CRISPR/Cas9 knockdown fan PSMG2 feroare de normale proteasoomfunksje, wat late ta autofagy-mediearre disassemblaasje fan PDPK1, wêrtroch tumorsellen yn TNBC-mûsmodellen fierder ferbettere waarden, feroarsake troch AZD6244 (MEK-remmer) en MG132 (proteasoomremmer). Sa kinne proteasoom- en MAP-kinase (MEK)-remmers synergistysk wurde administreare om tumorselproliferaasje te ferminderjen (Wang X. et al., 2022).
CRISPR/Cas9 is ek brûkt om te screenen op ferlies fan genfunksje dy't liedt ta TNBC-resistinsje (Shu et al., 2020). Ge et al. ferklearren it meganisme fan medisynresistinsje fan kankersellen behannele mei JQ1, in BET-bromodomeinremmer (BBDI), yn TNBC. Mei help fan CRISPR/Cas9 fûnen se dat it wiskjen fan it rb1-gen derfoar soarge dat TNBC resistint waard foar it anty-kankermedisyn JQ1. Dêrom is rb1-funksje wichtich yn 'e reaksje op JQ1-medisinen yn TNBC. Se rapportearren ek dat paclitaxel in CDK4/6 kinase/mikrotubule-remmer is, en de kombinaasje dêrfan mei BBDI's lykas JQ1 kin beloftefolle terapeutyske reaksjes jaan op medisynresistinte TNBC (Ge et al., 2020).
It transkripsjonele lânskip fan lange net-kodearjende RNA (lncRNA) is rapportearre ferantwurdlik te wêzen foar ferset tsjin neoadjuvante terapy yn TNBC. Dizze stúdzje lit sjen dat fiif ferskillende MALAT1 lncRNA-transkripten heech útdrukt wurde yn TNBC. Derneist fergrutte CRISPR/Cas9-bemiddelde deleasje fan MALAT1 de gefoelichheid fan TNBC BT-549-sellen foar paclitaxel en doxorubicine, wat suggerearret in potinsjele rol foar MALAT1-resistinsje yn TNBC (Shaath et al., 2021).
Mutaasjes yn BRCA1 (BRCA1m) binne heterogeen en dêrom lestich te detektearjen. It rjochtsjen op PARP1 (poly(ADP-ribose) polymerase), de synthetyske deadlike partner fan BRCA1, kin de gefoelichheid foar TNBC-medisinen ferheegje. Mei help fan CRISPR/Cas9 fergrutte it fuortheljen fan PARP1 de gefoelichheid fan antikankermedisinen lykas doxorubicine, gemcitabine en docetaxel foar mBRCA1-mutante TNBC-sellen, wat suggerearret dat PARP1 ek belutsen is by medisynresistinsje yn TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Mutaasjes yn 'e tumorsuppressorgenen BRCA1 of BRCA2 binne bekend om de kâns op it ûntwikkeljen fan boarstkanker by minsken te ferheegjen. Behanneling fan dizze pasjinten fereasket it gebrûk fan PARP-remmers. Derneist is oantoand dat knockout fan 'e nukleotide-salvagefaktor DNPH1 mei CRISPR/Cas9 it giftige nukleotide 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) monofosfaat kin ferwiderje, wêrtroch't de reaksje fan BRCA-tekoart oan sellen op gefoelichheid foar PARP-ynhibitoren ferbettere wurdt (Fugger et al., 2021). Sa kinne CRISPR/Cas9 en PARP1-ynhibitoren in wichtige behannelingstrategy wurde foar TNBC.
It penetrante glykoproteïne (P-gp)-gen is in multidrugresistinsjegen dat oer it algemien opregulearre is yn sawat 41% fan alle TNBC (Sun et al., 2020). P-gp-induzearre medisyn-efflux is identifisearre as in wichtige regulator fan medisynresistinsje by boarstkanker. P-gp-ynhibitoren hawwe ferhege gefoelichheid foar antikankermedisinen by boarstkanker oantoand (Famta et al., 2021). Dêrom kinne CRISPR/Cas9-bemiddelde ablaasje of ûnderdrukking fan P-gp en P-gp-ynhibitoren heul wichtige metoaden wêze om medisynresistinsje by TNBC te oerwinnen.
ATP-binende cassettetransporter G2 (ABCG2) is bekend om medisynresistinsje te feroarsaakjen yn TNBC (Palasuberniam et al., 2015), hoewol d'r op it stuit gjin rapporten binne oer de relaasje tusken CRISPR/Cas9 en ABCG2-stilmeitsjen en tumorsuppressorgen-inaktivaasje. PTEN kin ABCG2-aktivaasje ferbetterje (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Dêrom kin it brûken fan CRISP/Ca9 om ABCG2 te ferwiderjen en it te kombinearjen mei in ABCG2-remmer in geskikte behanneling wêze om medisynresistinsje yn TNBC te oerwinnen. Tabel 2 neamt CRISPR/Cas9 dy't rjochte is op alle resistinsjegenen.
Tabel 2. CRISPR/Cas9 rjochtet him op ferskate TNBC-resistinsjegenen om sellen gefoelich te meitsjen foar antikankermedisinen.
CRISPR/Cas9-bibleteken binne potinsjele ark foar it screenen fan genmutaasjes dy't ferbûn binne mei kankerpatogenese (Chan et al., 2022). Dizze screeningmetoade omfettet fjouwer stappen lykas (a) bibleteekkonstruksje, (b) lentivirale transduksje, (c) fenotypyske screening, en (d) doelgenanalyse. Hoewol TNBC abnormale aktivearring fan it MAPK-paad hat, is de klinyske prognose fan MEK-rjochte terapy foar TNBC-pasjinten dy't mutaasjes drage yn tumorsuppressorgenen lykas PTEN, RB1, en TP53 tige min.
Derneist testte in gen-knockout-screening mei CRISPR/Cas9 it machtichste en selektivste molekule, dehydrocatrol, dat oerfloedich is yn Guatemalteekse blom- en blêdekstrakten, om it effekt fan dehydrocatrol op MDA-MB-231 te begripen. Mekanismen fan selektive selcytotoxiciteit. Mesenchymale stamheidskarakteristiken fan TNBC-subtypen. Dizze CRISPR/Cas9-basearre screening liet ek sjen dat HSD17B11, in gen dat kodeart foar 17β-hydroxysteroïde dehydrogenase type 11, heech útdrukt wurdt yn MDA-MB-231-sellen en resulteart yn dehydrofalcarinol spesifyk foar MDA-MB-231-sellen (Grant et. al., 2020). Dit suggerearret dus dat CRISPR/Cas9 genomyske screening in grut potinsjeel hat yn it identifisearjen fan 'e meganismen dy't lizze ûnder de antykankereigenskippen fan potinsjele natuerlike ferbiningen.
Derneist waard de kwetsberens fan TNBC foar kanker bestudearre mei in ûnpartidige genoomwide in vivo CRISPR/Cas9-screening, dy't in ferbân sjen liet tusken onkogene en tumorsuppressorpaden. Wichtige komponinten fan 'e mTOR- en Hippo-paden binne rapportearre wichtige rollen te spyljen yn tumorregeling yn TNBC. Derneist hawwe stúdzjes oantoand dat farmakologyske ynhibysje fan mTORC1/2 en YAP-onkoproteïne effektyf de patogeniteit fan TNBC remt mei in in vitro medisynmatrix-synergymodel en in vivo pasjint-ôflaatte xenografts. Boppedat fersterket Torin-1-bemiddelde mTORC1/2-ynhibysje makropinocytose, wylst verteporfin-induzearre YAP-ynhibysje liedt ta TNBC-seldea. Tegearre markearje dizze resultaten de krêft en robuustheid fan genoomwide in vivo CRISPR-screening om nije en effektive behannelingen foar TNBC te identifisearjen (Dai et al., 2021).
Dysregeling fan it ymmúnsysteem is in wichtige faktor yn tumorgenese. Kankersellen ûntkomme oan ymmúnklaring troch ferdigeningsmeganismen te omgean, ynklusyf it bemuoien mei de aktiviteit fan ymmúnsellen yn 'e tumor-mikroomjouwing en it kompromittearjen fan it ymmúnsysteem. Dêrom kin it ûntwikkeljen fan in ferbettere ymmúnsysteem in wichtige oanpak wêze foar it bestriden fan tumors. It gebrûk fan CRISPR/Cas9-basearre genmodifikaasje behannelet ferskate problemen yn ferbân mei ymmúndysfunksje út ferskate perspektiven. CRISPR/Cas9 is brûkt om antitumor-ymmúniteit tsjin boarstkanker te ferbetterjen fia de folgjende paden (Ofbylding 3).
Figuer 3. CRISPR/Cas9-immunoterapy rjochtet him op TNBC-sellen. Ferlies fan CDK5 en it delheljen fan PDL1 en CD155 fersterkje it ymmúnsysteem. Likegoed fergrutte ferlies fan A2AR en it delheljen fan TAA's lykas HER2, mucine 1 en TEM8 de effisjinsje fan CAR-T-sellen by it deadzjen fan kankersellen. CRISPR/Cas9-oandreaune T-selscreening hat oantoand dat fersteuring fan p38-kinase de antitumoraktiviteit fan T-sellen fersterket. T-sellen modifisearre troch CRISPR/Cas9 ferheegje de ekspresje fan TCR (T-selreseptor), wat resulteart yn T-sellen dy't antitumoraktiviteit hawwe.
It doel fan immunoterapy is om it ymmúnsysteem te stimulearjen om kankersellen oan te fallen. Oerekspresje fan ymmúnkontrôlepuntproteinen foarkomt meastentiids autoimmune reaksjes, mar kin kankers helpe om se te foarkommen (Topalian et al., 2015). Dizze proteinen foarkomme ymmúnreaksjes troch te binen oan reseptors op it oerflak fan ymmúnsellen. Meardere kontrôlepuntproteinen (lykas CD155 en PD-L1) rjochtsje har op 'e PD-1-reseptor op ymmúnsellen en wurde útdrukt yn boarstkanker, benammen TNBC (Li Y.-C. et al., 2020). It ûnderdrukken fan PD-L1 of syn reseptor mei CRISPR/Cas9 kin it ymmúnsysteem stimulearje om TNBC-tumors oan te fallen (Yahata et al., 2019). Derneist is oantoand dat delregeling fan PD-L1-ekspresje fia CRISPR/Cas9-bemiddelde ferwidering fan CDK5 tumorgroei yn vitro en yn vivo remt (Deng et al., 2020). Groei-ynhibysje yn in vitro- en in vivo-modellen fan boarstkanker suggerearret dat shRNA-bemiddelde reduksje fan CD155 in terapeutysk effekt kin hawwe op boarstkanker (Gao et al., 2018).
CAR T-sellen ekspressearje CAR's dy't tumor-assosjeare antigenen (TAA's) werkenne en kinne knockdown fan checkpoint-proteinen brûke om har aktiviteit te ferbetterjen (Li C. et al., 2020). D'r binne ferskate potinsjele doelen foar CAR T-selterapy by boarstkanker, ynklusyf ferskate TAA's lykas HER2, mucin1, en TEM8 (Bajgain et al., 2018). D'r is bewiis dat CAR T-sellen dy't rjochte binne op mesotheline (oerekspressearre yn TNBC BT-459-sellen) effektiver binne tsjin kanker as PD-1 útskeakele wurdt mei CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). It isolearjen fan T-sellen fan pasjinten en se dan ex vivo te bewurkjen is lykwols in arbeidsyntinsyf en tiidslinend proses. Hoewol universele T-sellen de isolaasjeeasken kinne ferminderje, moatte donor T-sellen dy't minsklik leukocytenantigen (HLA) klasse I en T-selreseptor (TCR) ekspressearje, fuorthelle wurde om graft-versus-host-abnormaliteiten te foarkommen (Ren et al., 2017, 2017a). Mei help fan CRISPR/Cas9 kin HDR tagelyk TCR en HLA eliminearje en it gen dat kodeart foar CAR útskeakelje. Undersyk hat oantoand dat CRISPR/Cas9 brûkt wurde kin om anti-CD19 CAR's yn 'e TCR-lokus yn te fieren, wêrtroch't CAR's effisjint produsearre wurde sûnder T-sellen út te putten (Dimitri et al., 2022). Multiplex-technologyen binne ûntwikkele om allogene CAR T-sellen te generearjen troch tagelyk TCR, beta-2-mikroglobuline (B2M), HLA-I-subeenheid en oare proteïnen lykas PD-1 en CTLA-4 te eliminearjen, dy't miskien bettere anty-kanker-eigenskippen hawwe tsjin TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
It brûken fan CRISPR/Cas9 koe de effektiviteit fan CAR-T-sellen ferbetterje. Adenosine is bekend om immunosuppressive eigenskippen te hawwen en kin antikanker-immuniteit ferminderje troch T-selfunksje te blokkearjen en adenosine A2A-receptors (A2AR) te aktivearjen (Vigano et al., 2019). It stilmeitsjen fan A2AR mei CRISPR/Cas9 ferbettere de effektiviteit fan CAR-T-sellen yn vivo signifikant (Giuffrida et al., 2021). T-sellen binne bekend om ferskate fenotypyske skaaimerken te fertoanen lykas sellulêre útwreiding, differinsjaasje, oksidative stress en genomyske stress. CRISPR/Cas9-basearre T-selscreening liet fersteuring fan 25 ferskillende T-selreceptorkinasen sjen. Under harren is oantoand dat ferwidering fan p38-kinase de antitumoraktiviteit fan T-sellen ferbetteret, wat oanjout dat p38-kinase in wichtige regulator is fan CAR-T-selregeling (Gurusamy et al., 2020).
T-sellen kinne genetysk modifisearre wurde mei CRISPR/Cas9 om heech útdrukte TCR's te produsearjen. It oerdragen fan genetysk modifisearre T-sellen nei pasjinten hat sterkere anty-kankeraktiviteit sjen litten as endogene T-sellen. Dêrom kinne endogene TCR's konkurrearje mei genetysk feroare TCR's by pasjinten, wat ynfloed kin hawwe op it potinsjeel fan kanker-immunoterapy. Om dit probleem te oerwinnen, kin it brûken fan CRISPR/Cas9 om endogene TCR-β yn ûntfangersellen te ferwiderjen en dêrnei TCR-β T-sellen oer te dragen nei kankerpasjinten bettere anty-kanker-ymmúnreaksjes sjen litte sûnder de needsaak foar endogene TCR seksuele konkurrinsje (Fan et al. 2018). Sa binne, mei útsûndering fan CRISPR-modifisearre T-sellen, TCR's tûzen kear gefoeliger foar tumorantigenen as normale TCR-transdusearre T-sellen. Derneist litte by ferskate leukemyen feroare T-sellen generearre troch γδ TCR+ CRISPR hegere ekspresje fan CD4+ en CD8+ T-sellen sjen as standert TCR-oerdracht (Legut et al., 2018). Sa kinne modifisearre T-sellen generearre troch CRISPR/Cas9 in effektive immunoterapymetoade wêze om TNBC te oerwinnen.
Integrinen binne seladhesiemolekulen dy't oanwêzich binne yn sellulêre transmembranen en de binding fan sellen oan 'e ekstrasellulêre matrix (ECM) befoarderje (Hamidi en Ivaska, 2018). Dysregeling fan integrinen wurdt assosjeare mei kankerûntwikkeling en migraasje troch it feroarjen fan 'e ekstrasellulêre matrix, wat liedt ta it oerlibjen fan kankersellen yn 'e sirkulaasje (Hamidi en Ivaska, 2018). CRISPR/Cas9-mediearre integrin knockdown fertraget tumorprogresje, metastase en kolonisaasje yn TNBC. Knockdown fan integrin a5 (ITGA5) is rapportearre om selmigraasje en -progresje yn oare kankersoarten lykas longkanker te ferminderjen (Ju et al., 2017), wat suggerearret dat integrin a5 ek in wichtige faktor kin wêze yn 'e patogenese fan TNBC.
It generearjen fan knockout-mûzen mei tradisjonele embryonale stamselmetoaden (ES) is in arbeidsyntinsyf, tiidslinend en ineffisjint proses. It duorret moannen en jierren om ES-sellen te rjochtsjen fia homologe rekombinaasje, chimere mûzen te fokken en se dan te krusen mei heterozygote mûzen om homozygote neiteam te produsearjen. Komplekse krusing is fereaske om mûzen mei meardere genetyske mutaasjes te meitsjen. In protte problemen binne lykwols ûntstien by it brûken fan mûzen dy't generearre binne troch ablaasje fan ES-sellen mei CRISPR/Cas9 of troch mikro-ynjeksje fan CRISPR/Cas9-komponinten yn iensellige befruchte aaien. Bygelyks, ynfiering fan feroaringen komt faak foar op biallelyske loci en is net genspesifyk. Koartlyn waard rapportearre dat ES-sellen mei CRISPR/Cas9-technology tagelyk biallelyske mutaasjes kinne ynfoegje yn maksimaal 5 genen (Nishizono et al., 2021). Foar dit doel waarden Cas9 mRNA en fiif genspesifike gRNA's tagelyk transfektearre yn ES-sellen. Dit ûnderstreket de belofte en effektiviteit fan dizze proseduere, hoewol dizze mutaasjes mooglik trochjûn binne doe't oprjochterslinen waarden fokt om fiifvoudige knockout-mûzen te produsearjen. De stúdzje rapportearret ek in ferrassende ûntdekking: ES-sellen binne net langer nedich om genetysk modifisearre mûzen te meitsjen. Ynstee dêrfan waarden Cas9 mRNA en gRNA ynjektearre yn embryo's yn it iensellige stadium om spesifike genprodukten te ferwiderjen. As gefolch binne knockout-oprjochterslinen makke dy't teoretysk brûkt wurde kinne om de gefolgen fan gendeleasje by mûzen te bestudearjen (Qin et al., 2016). Sa makket CRISPR/Cas9 de skepping fan transgene mûzen mooglik om TNBC te behanneljen tsjin legere kosten as tradisjonele genetyske technyk. Mei it CRISPR/Cas-systeem is in nij knockout-mûsmodel ûntwikkele dat mei súkses puntmutaasjes yn ien of mear endogene genen yn TNBC yntrodusearje kin. Op basis fan dit konsept kinne diermodellen fan TNBC ek ûntwikkele wurde mei CRISPR/Cas9-bemiddelde deleasje fan BRCA1 en p53, wat resulteart yn ferlies fan HR-reparaasje, genomyske ynstabiliteit en mutante fenotypen (Annunziato et al., 2020).
Op it stuit wurde ferskate metoaden lykas mammografy, magnetyske resonânsjeôfbylding (MRI) en echografie brûkt om TNBC te diagnostisearjen. Dizze metoaden hawwe lykwols wat beheiningen. Mammografy wurdt brûkt om lokaal boarstweefsel te diagnostisearjen ynstee fan metastazen, wêr't kankersellen nei oare organen migrearre binne. Echografie is gjin betroubere metoade foar it diagnostisearjen fan TNBC (Chen en Lee-Felker, 2023). MRI hat in hegere gefoelichheid as echografie en mammografy, mar de diagnostyske krektens is beheind (Sha en Chen, 2022). Weefselbiopsie is in invasive manier om kankersellen te identifisearjen. Yn guon gefallen kin in biopsie lykwols kankerweefsel misse as de nulle fan it gebiet fan belang ôfdwaalt. Derneist is it tige djoer en kin it traumatysk wêze foar de pasjint. TNBC is in heterogeen type kanker, dus in biopsie kin miskien net genôch ynformaasje jaan oer it type kanker. Dêrom is in nije diagnostysk betroubere metoade foar it opspoaren fan TNBC driuwend nedich. CRISPR/Cas9 kin tsjinje as in tige gefoelich en minimaal invasyf alternatyf foar boarstkankerdiagnoaze. Hjirfoar kinne CRISPR/Cas9-basearre strategyen brûkt wurde om PCR-metoaden foar de diagnoaze fan TNBC te ferbetterjen. Earst wurde de Cas9- en cpf1-proteinen fan it CRISPR-systeem brûkt om net-spesifyk DNA te ferwiderjen, en dan kinne dizze twa proteinen (Cas9 en cpf1) de PAM-sekwinsje werkenne foardat se oan it doel-DNA binde (Deepak Singh et al., 2021). Sa kin PCR mutaasjes identifisearje dy't ferbûn binne mei kankerûntwikkeling. Ferskate stúdzjes hawwe dizze CRISPR-basearre strategy oannaam om ferskate mutaasjes yn ferskate kankers te detektearjen (Safari et al., 2019). Sa kinne CRISPR-basearre PCR-metoaden de ôfhinklikens fan TNBC-diagnoaze fan invasive metoaden lykas biopsie-basearre immunohistochemy ferminderje.
Genotypyske feroarings yn hormoanreseptorregeling binne ek oantoand yn TNBC (Chen en Russo, 2009). CRISPR/Cas9-basearre PCR-strategyen mei microarrays foar point-of-care-diagnostyk kinne dizze mutaasjes effektyf kontrolearje (Hajian et al., 2019). It koe sûnenssoarchferlieners ek relevante ynformaasje jaan oer spesifike mutaasjes yn TNBC-pasjinten, wat har behanneling kin ferbetterje. Dizze kombineare technyk hat lykwols beheiningen. Dêrom binne wiidweidige ûndersyksynspanningen nedich foardat dizze CRISPR/Cas-PCR-metoade yn 'e sûnenssoarch brûkt wurde kin foar de diagnoaze fan TNBC (Yang et al., 2019).
Pleatsingstiid: 14 oktober 2024