Differinsjaal diagnoaze fan pulmonary nodules identifisearre troch computed tomography (CT) bliuwt in útdaging yn klinyske praktyk.Hjir karakterisearje wy it wrâldwide metabolom fan 480 serummonsters, ynklusyf sûne kontrôles, goedaardige longnodules, en stadium I longadenokarcinoma.Adenocarcinomas eksposearje unike metabolomyske profilen, wylst goedaardige nodules en sûne persoanen in hege oerienkomst hawwe yn metabolomyske profilen.Yn 'e ûntdekkingsgroep (n = 306) waard in set fan 27 metabolites identifisearre om te ûnderskieden tusken goedaardige en maligne nodules.De AUC fan it diskriminearjende model yn 'e ynterne falidaasje (n = 104) en eksterne falidaasje (n = 111) groepen wie respektivelik 0.915 en 0.945.Pathway-analyze die bliken tanommen glycolytic metabolites ferbûn mei fermindere tryptofan yn lung adenocarcinoma serum yn ferliking mei goedaardige nodules en sûn kontrôles, en suggerearre dat tryptofan opname befoarderet glycolysis yn longkanker sellen.Us stúdzje markeart de wearde fan serummetabolitebiomarkers by it beoardieljen fan it risiko fan pulmonale nodules ûntdutsen troch CT.
Iere diagnoaze is kritysk om it oerlibjensnivo te ferbetterjen foar kankerpasjinten.Resultaten fan 'e US National Lung Cancer Screening Trial (NLST) en de Jeropeeske NELSON-stúdzje hawwe oantoand dat screening mei leechdosis komputearre tomografy (LDCT) de mortaliteit fan longkanker signifikant kin ferminderje yn groepen mei hege risiko's1,2,3.Sûnt it wiidferspraat gebrûk fan LDCT foar longkanker-screening, is de ynsidinsje fan ynsidintele radiografyske befiningen fan asymptomatyske pulmonêre nodules trochgean te ferheegjen 4 .Pulmonary nodules wurde definiearre as fokale opaciteiten oant 3 sm yn diameter 5 .Wy steane foar swierrichheden by it beoardieljen fan de wikseling fan maligniteit en it omgean mei it grutte oantal pulmonale nodules ûntdutsen ynsidinteel op LDCT.Beheinings fan CT kinne liede ta faak ferfolchûndersiken en falsk-positive resultaten, dy't liede ta ûnnedige yntervinsje en oerbehanneling6.Dêrom is d'r needsaak om betroubere en nuttige biomarkers te ûntwikkeljen om longkanker yn 'e iere stadia korrekt te identifisearjen en de measte goedaardige nodules te ûnderskieden by inisjele deteksje 7.
Wiidweidige molekulêre analyze fan bloed (serum, plasma, mononukleêre sellen fan perifeare bloed), ynklusyf genomics, proteomics of DNA-methylaasje8,9,10, hat laat ta groeiende belangstelling foar de ûntdekking fan diagnostyske biomarkers foar longkanker.Underwilens mjitte metabolomika-oanpak sellulêre einprodukten dy't wurde beynfloede troch endogene en eksogene aksjes en wurde dêrom tapast om it begjin en de útkomst fan sykte te foarsizzen.Liquid chromatography-tandem massa spektrometrie (LC-MS) is in breed brûkte metoade foar metabolomics stúdzjes fanwege syn hege gefoelichheid en grutte dynamyske berik, dat kin dekke metabolites mei ferskillende fysysk-gemyske eigenskippen11,12,13.Hoewol wrâldwide metabolomyske analyze fan plasma / serum is brûkt om biomarkers te identifisearjen dy't ferbûn binne mei longkankerdiagnoaze14,15,16,17 en effektiviteit fan behanneling, 18 serummetaboliteklassifikaasjes om te ûnderskieden tusken goedaardige en maligne longnodules bliuwe noch folle studearre.-massive ûndersyk.
Adenocarcinoma en squamous cell carcinoma binne de twa haadsubtypen fan net-lytse sel longkanker (NSCLC).Ferskate CT-screeningtests jouwe oan dat adenocarcinoma it meast foarkommende histologyske type fan longkanker1,19,20,21 is.Yn dizze stúdzje brûkten wy ultra-optredende floeistofchromatografy-hege resolúsje massaspektrometrie (UPLC-HRMS) om metabolomika-analyze út te fieren op in totaal fan 695 serummonsters, ynklusyf sûne kontrôles, goedaardige pulmonêre nodules, en CT-detectearre ≤3 sm.Screening foar Stage I lung adenocarcinoma.Wy identifisearre in paniel fan serummetaboliten dy't longadenokarcinoma ûnderskiede fan goedaardige nodules en sûne kontrôles.Pathway-ferrikingsanalyse die bliken dat abnormale tryptofan- en glukoazemetabolisme gewoane feroaringen binne yn longadenokarcinoma yn ferliking mei goedaardige nodules en sûne kontrôles.Uteinlik hawwe wy in serummetabolike klassifikaasje oprjochte en validearre mei hege spesifisiteit en gefoelichheid om te ûnderskieden tusken maligne en goedaardige pulmonêre nodules ûntdutsen troch LDCT, wat kin helpe by betide differinsjaal diagnoaze en risiko-beoardieling.
Yn 'e aktuele stúdzje waarden seks- en leeftyd oerienkommende serummonsters retrospektyf sammele fan 174 sûne kontrôles, 292 pasjinten mei goedaardige pulmonale nodules, en 229 pasjinten mei stadium I longadenokarcinoma.Demografyske skaaimerken fan 'e 695 ûnderwerpen wurde werjûn yn oanfoljende tabel 1.
Lykas werjûn yn figuer 1a, waarden in totaal fan 480 serummonsters, ynklusyf 174 sûne kontrôle (HC), 170 goedaardige nodules (BN), en 136 stadium I lung adenocarcinoma (LA) samples sammele by Sun Yat-sen University Cancer Center.Untdekkingskohort foar net-targete metabolomyske profilearring mei ultra-prestaasjes floeistofchromatografy-massspektrometry mei hege resolúsje (UPLC-HRMS).Lykas werjûn yn oanfoljende figuer 1, waarden differinsjaal metaboliten tusken LA en HC, LA en BN identifisearre om in klassifikaasjemodel te fêstigjen en differinsjaalpaadanalyse fierder te ûndersykjen.104 samples sammele troch Sun Yat-sen University Cancer Center en 111 samples sammele troch twa oare sikehûzen waarden respektivelik ûnderwurpen oan ynterne en eksterne falidaasje.
in Undersykpopulaasje yn 'e ûntdekkingskohort dy't wrâldwide serummetabolomika-analyze ûndergie mei ultra-prestaasjes floeistofchromatografy-hege resolúsje massaspektrometrie (UPLC-HRMS).b Partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) fan it totale metabolome fan 480 serummonsters út 'e stúdzjekohort, ynklusyf sûne kontrôles (HC, n = 174), goedaardige nodules (BN, n = 170), en stadium I longadenokarcinoma (Los Angeles, n = 136).+ ESI, positive electrospray ionisaasje modus, -ESI, negative electrospray ionisaasje modus.c–e Metaboliten mei signifikant ferskillende oerfloeden yn twa opjûne groepen (twa-tailed Wilcoxon ûndertekene rangtest, falske ûntdekkingsnivo oanpast p-wearde, FDR <0.05) wurde werjûn yn read (fold feroaring> 1.2) en blau (fold feroaring <0.83) .) werjûn op 'e fulkaangrafyk.f Hierarchical clustering waarmte map showing wichtige ferskillen yn it oantal annotated metabolites tusken LA en BN.Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
De totale serummetabolom fan 174 HC, 170 BN en 136 LA yn 'e ûntdekkingsgroep waard analysearre mei UPLC-HRMS-analyse.Wy litte earst sjen dat kwaliteitskontrôle (QC)-samples strak klusteren yn it sintrum fan in net-bestjoerde haadkomponintanalyse (PCA) model, befêstigje de stabiliteit fan 'e prestaasjes fan' e hjoeddeistige stúdzje (oanfoljende figuer 2).
Lykas werjûn yn 'e partiel minste kwadraten-diskriminante analyze (PLS-DA) yn figuer 1b, fûnen wy dat d'r dúdlike ferskillen wiene tusken LA en BN, LA en HC yn positive (+ ESI) en negative (-ESI) elektrosprayionisaasjemodi .ôfsûnderje.Der waarden lykwols gjin signifikante ferskillen fûn tusken BN en HC yn +ESI- en -ESI-betingsten.
Wy fûnen 382 differinsjaalfunksjes tusken LA en HC, 231 differinsjaalfunksjes tusken LA en BN, en 95 differinsjaalfunksjes tusken BN en HC (Wilcoxon ûndertekene rangtest, FDR <0.05 en meardere feroaring>1.2 of <0.83) (Figure .1c-e) )..Peaks waarden fierder annotearre (oanfoljende gegevens 3) tsjin in databank (mzCloud / HMDB / Chemspider bibleteek) troch m / z wearde, retensjonstiid en fragmintaasje massa spektrum sykjen (details beskreaun yn metoaden seksje) 22.Uteinlik waarden 33 en 38 annotearre metaboliten mei signifikante ferskillen yn oerfloed identifisearre foar LA tsjin BN (figuer 1f en oanfoljende tabel 2) en LA fersus HC (oanfoljende figuer 3 en oanfoljende tabel 2), respektivelik.Yn tsjinstelling waarden allinich 3-metaboliten mei signifikante ferskillen yn oerfloed identifisearre yn BN en HC (oanfoljende tabel 2), yn oerienstimming mei de oerlap tusken BN en HC yn PLS-DA.Dizze differinsjaal metabolites dekke in breed oanbod fan biogemyske stoffen (oanfoljende figuer 4).Mei-inoar bewize dizze resultaten signifikante feroaringen yn it serummetabolom dy't maligne transformaasje fan longkanker yn 'e iere faze reflektearje yn fergeliking mei goedaardige longnodules as sûne ûnderwerpen.Underwilens suggerearret de oerienkomst fan it serummetabolom fan BN en HC dat goedaardige pulmonêre nodules in protte biologyske skaaimerken diele kinne mei sûne yndividuen.Sjoen dat epidermale groeifaktorreceptor (EGFR) genmutaasjes gewoan binne yn longadenokarcinoma subtype 23, sochten wy de ynfloed fan bestjoerdermutaasjes op it serummetaboloom te bepalen.Wy analysearren doe it algemiene metabolomyske profyl fan 72 gefallen mei EGFR-status yn 'e longadenokarcinoma-groep.Ynteressant fûnen wy fergelykbere profilen tusken EGFR mutante pasjinten (n = 41) en EGFR wyldtype pasjinten (n = 31) yn PCA-analyze (oanfoljende figuer 5a).Wy identifisearren lykwols 7-metaboliten wêrfan de oerfloed signifikant feroare waard yn pasjinten mei EGFR-mutaasje yn ferliking mei pasjinten mei wyldtype EGFR (t-test, p <0.05 en fold feroaring> 1.2 of <0.83) (oanfoljende figuer 5b).De mearderheid fan dizze metabolites (5 fan 7) binne acylcarnitines, dy't in wichtige rol spylje yn fatty acid oksidaasjepaden.
Lykas yllustrearre yn 'e workflow werjûn yn figuer 2a, waarden biomarkers foar nodule-klassifikaasje krigen mei de minste absolute krimpoperators en seleksje basearre op 33 differinsjaal metabolites identifisearre yn LA (n = 136) en BN (n = 170).Bêste kombinaasje fan fariabelen (LASSO) - binêre logistyske regressionmodel.Tsienfâldige krúsvalidaasje waard brûkt om de betrouberens fan it model te testen.Fariabele seleksje en parameterregularisaasje wurde oanpast troch in straf foar maksimalisaasje fan kâns mei parameter λ24.Globale metabolomics-analyze waard fierder ûnôfhinklik útfierd yn 'e ynterne falidaasje (n = 104) en eksterne falidaasje (n = 111) groepen om de klassifikaasjeprestaasjes fan it diskriminearjende model te testen.As gefolch dêrfan waarden 27-metaboliten yn 'e ûntdekkingsset identifisearre as it bêste diskriminearjende model mei de grutste gemiddelde AUC-wearde (Fig. 2b), wêrby't 9 aktiviteit ferhege en 18 fermindere aktiviteit yn LA yn ferliking mei BN (Fig. 2c).
Workflow foar it bouwen fan in pulmonary nodule-klassifikaasje, ynklusyf it selektearjen fan it bêste paniel fan serummetaboliten yn 'e ûntdekkingsset mei in binêre logistysk regressionmodel fia tsienfâldige krúsvalidaasje en it evaluearjen fan foarsizzende prestaasjes yn ynterne en eksterne falidaasjesets.b Cross-validaasjestatistiken fan LASSO-regressionmodel foar seleksje fan metabolike biomarkers.De hjirboppe jûne nûmers fertsjintwurdigje it gemiddelde oantal biomarkers selekteare op in opjûne λ.De reade stippelline stiet foar de gemiddelde AUC-wearde by de oerienkommende lambda.Grize flaterbalken fertsjintwurdigje de minimale en maksimale AUC-wearden.De stippelline jout it bêste model oan mei de 27 selekteare biomarkers.AUC, gebiet ûnder de kromme fan 'e ûntfanger operearjend karakteristyk (ROC).c Fold feroaringen fan 27 selekteare metaboliten yn 'e LA-groep yn ferliking mei de BN-groep yn' e ûntdekkingsgroep.Reade kolom - aktivearring.De blauwe kolom is in delgong.d–f Receiver operating characteristic (ROC) curves dy't de krêft sjen litte fan it diskriminearjende model basearre op 27 metabolite kombinaasjes yn 'e ûntdekking, ynterne en eksterne falidaasje sets.Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
In foarsizzingsmodel waard makke op basis fan de gewichtige regressionkoëffisjinten fan dizze 27 metaboliten (oanfoljende tabel 3).ROC-analyze basearre op dizze 27 metabolites levere in gebiet ûnder de kromme (AUC) wearde fan 0.933, ûntdekkingsgroepsensitiviteit wie 0.868, en spesifisiteit wie 0.859 (Fig. 2d).Underwilens, ûnder de 38 annotearre differinsjaalmetaboliten tusken LA en HC, berikte in set fan 16 metaboliten in AUC fan 0.902 mei in gefoelichheid fan 0.801 en spesifisiteit fan 0.856 yn diskriminearjen fan LA fan HC (oanfoljende figuer 6a-c).AUC-wearden basearre op ferskate foldwizigingsdrompels foar differinsjaal metaboliten waarden ek fergelike.Wy fûnen dat it klassifikaasjemodel it bêste prestearre yn it diskriminearjen tusken LA en BN (HC) doe't it foldwizigingsnivo waard ynsteld op 1.2 tsjin 1.5 of 2.0 (oanfoljende figuer 7a,b).It klassifikaasjemodel, basearre op 27 metabolite groepen, waard fierder validearre yn ynterne en eksterne kohorten.De AUC wie 0.915 (sensitiviteit 0.867, spesifisiteit 0.811) foar ynterne falidaasje en 0.945 (sensitiviteit 0.810, spesifisiteit 0.979) foar eksterne falidaasje (Fig. 2e, f).Om de effisjinsje fan ynterlaboratoarium te beoardieljen, waarden 40-samples fan 'e eksterne kohort analysearre yn in ekstern laboratoarium lykas beskreaun yn' e seksje Metoaden.De krektens fan 'e klassifikaasje berikte in AUC fan 0.925 (oanfoljende figuer 8).Om't lung squamous cell carcinoma (LUSC) it twadde meast foarkommende subtype is fan net-lytse sel longkanker (NSCLC) nei lung adenocarcinoma (LUAD), testen wy ek it falidearre potensjele nut fan metabolike profilen.BN en 16 gefallen fan LUSC.De AUC fan diskriminaasje tusken LUSC en BN wie 0.776 (oanfoljende figuer 9), wat oanjout op earmere fermogen yn ferliking mei diskriminaasje tusken LUAD en BN.
Stúdzjes hawwe oantoand dat de grutte fan nodules op CT-ôfbyldings posityf korrelearre is mei de kâns op maligniteit en bliuwt in wichtige determinant fan nodule behanneling25,26,27.Analyse fan gegevens fan 'e grutte kohort fan' e NELSON-screeningstúdzje liet sjen dat it risiko fan maligniteit yn ûnderwerpen mei knooppunten <5 mm sels fergelykber wie mei dat yn ûnderwerpen sûnder knooppunten 28 .Dêrom is de minimale grutte dy't reguliere CT-monitoring nedich is 5 mm, lykas oanrikkemandearre troch de British Thoracic Society (BTS), en 6 mm, lykas oanrikkemandearre troch de Fleischner Society 29 .Nodules grutter dan 6 mm en sûnder dúdlike goedaardige funksjes, neamd ûnbepaalde pulmonary nodules (IPN), bliuwe in grutte útdaging yn evaluaasje en behear yn klinyske praktyk30,31.Wy ûndersochten dêrnei oft de nodulegrutte beynfloede metabolomyske hantekeningen mei gebrûk fan sammele samples út 'e ûntdekkings- en ynterne falidaasjekohorten.Fokus op 27 validearre biomarkers, fergelike wy earst de PCA-profilen fan HC en BN sub-6 mm metabolomen.Wy fûnen dat de measte gegevenspunten foar HC en BN oerlappe, wat oantoand dat serummetabolitenivo's yn beide groepen ferlykber wiene (Fig. 3a).De funksje kaarten oer ferskillende grutte berik bleau bewarre yn BN en LA (Fig. 3b, c), wylst in skieding waard waarnommen tusken maligne en goedaardige nodules yn de 6-20 mm berik (Fig. 3d).Dizze kohort hie in AUC fan 0.927, spesifisiteit fan 0.868, en sensibiliteit fan 0.820 foar it foarsizzen fan de maligniteit fan nodules dy't 6 oant 20 mm mjitten (fig. 3e, f).Us resultaten litte sjen dat de klassifikaasje metabolike feroarings kin fange feroarsake troch iere maligne transformaasje, nettsjinsteande nodulegrutte.
ad Fergeliking fan PCA-profilen tusken spesifisearre groepen basearre op in metabolike klassifikaasje fan 27 metaboliten.CC en BN < 6 mm.b BN < 6 mm vs BN 6–20 mm.yn LA 6-20 mm tsjin LA 20-30 mm.g BN 6-20 mm en LA 6-20 mm.GC, n = 174;BN < 6 mm, n = 153;BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20-30 mm, n = 77. e Receiver operating characteristic (ROC) curve showing diskriminant model prestaasjes foar nodules 6-20 mm.f Wierskynlikwearden waarden berekkene op basis fan it logistyske regressionmodel foar nodules dy't 6-20 mm mjitten.De grize stippelline stiet foar de optimale cutoffwearde (0,455).De sifers hjirboppe fertsjintwurdigje it persintaazje gefallen projizearre foar Los Angeles.Brûk in twa-tailed Student's t-test.PCA, wichtichste komponint analyze.AUC gebiet ûnder de kromme.Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
Fjouwer samples (leeftyd 44-61 jier) mei ferlykbere pulmonêre nodulegrutte (7-9 mm) waarden fierder selektearre om de prestaasjes fan it foarstelde maligniteitsfoarsizzingsmodel te yllustrearjen (Fig. 4a, b).Op inisjele screening, Case 1 presintearre as in solide knobbel mei kalkifikaasje, in funksje assosjearre mei benigniteit, wylst Case 2 presintearre as in ûnbepaalde foar in part solide knoop mei gjin dúdlike goedaardige funksjes.Trije rûnen fan opfolgjende CT-scans lieten sjen dat dizze gefallen stabyl bleaunen oer in perioade fan 4 jier en waarden dêrom beskôge as goedaardige nodules (Fig. 4a).Yn ferliking mei klinyske evaluaasje fan seriële CT-scans, identifisearre single-shot serummetabolytanalyse mei it hjoeddeistige klassifikaasjemodel dizze goedaardige nodules fluch en korrekt op basis fan probabilistyske beheiningen (tabel 1).Figuer 4b yn gefal 3 lit in nodule sjen mei tekens fan pleurale retraksje, dy't meast ferbûn is mei maligniteit32.Gefal 4 presintearre as in ûnbepaalde foar in part fêste knobbel sûnder bewiis fan in goedaardige oarsaak.Al dizze gefallen waarden foarsein as malignant neffens it klassifikaasjemodel (tabel 1).De beoardieling fan longadenokarcinoma waard oantoand troch histopatologysk ûndersyk nei longreseksjechirurgie (fig. 4b).Foar de eksterne validaasje set foarsei de metabolike klassifikaasje twa gefallen fan ûnbepaalde longnodules grutter dan 6 mm (oanfoljende figuer 10).
CT-ôfbyldings fan it axiale finster fan 'e longen fan twa gefallen fan goedaardige nodules.Yn gefal 1 liet de CT-scan nei 4 jier in stabile solide nodule fan 7 mm sjen mei kalkifikaasje yn 'e rjochter legere lobe.Yn gefal 2 liet CT-scan nei 5 jier in stabile, foar in part fêste nodule sjen mei in diameter fan 7 mm yn 'e rjochter boppeste lobe.b Axial finster CT-ôfbyldings fan 'e longen en oerienkommende patologyske stúdzjes fan twa gefallen fan stadium I adenocarcinoma foar longreseksje.Case 3 iepenbiere in nodule mei in diameter fan 8 mm yn 'e rjochter boppeste lobe mei pleurale retraksje.Gefal 4 die bliken in foar in part solide grûn-glês nodule mjitten 9 mm yn de linker boppeste lobe.Hematoxylin en eosin (H&E) kleuring fan resektearre longweefsel (skaalbalke = 50 μm) dy't it acinar groeipatroan fan longadenokarcinoma oantoand.Pylken jouwe nodules oan ûntdutsen op CT-ôfbyldings.H&E-ôfbyldings binne represintative bylden fan meardere (> 3) mikroskopyske fjilden ûndersocht troch de patolooch.
Mei-inoar bewize ús resultaten de potensjele wearde fan serummetabolitebiomarkers yn 'e differinsjaal diagnoaze fan pulmonale nodules, dy't útdagings kinne foarmje by it evaluearjen fan CT-screening.
Op grûn fan in validearre differinsjaal metabolitepaniel sochten wy biologyske korrelaten fan grutte metabolike feroaringen te identifisearjen.KEGG-paadferrikingsanalyse troch MetaboAnalyst identifisearre 6 mienskiplike signifikant feroare paden tusken de twa opjûne groepen (LA vs. HC en LA vs. BN, oanpast p ≤ 0.001, effekt> 0.01).Dizze wizigingen waarden karakterisearre troch steuringen yn pyruvatmetabolisme, tryptofan-metabolisme, niacin en nicotinamide-metabolisme, glycolyse, de TCA-syklus en purine-metabolisme (figuer 5a).Wy diene dan fierder doelgerichte metabolomics om grutte feroaringen te ferifiearjen mei absolute kwantifikaasje.Bepaling fan mienskiplike metabolites yn gewoan feroare paden troch triple quadrupole massaspektrometry (QQQ) mei help fan autentike metabolite noarmen.Demografyske skaaimerken fan 'e doelprobe foar metabolomics-stúdzje binne opnommen yn oanfoljende tabel 4. Yn oerienstimming mei ús globale metabolomics-resultaten, befêstige kwantitative analyze dat hypoxanthine en xanthine, pyruvate en laktaat yn LA ferhege waarden yn ferliking mei BN en HC (Fig. 5b, c, p <0,05).Gjin signifikante ferskillen yn dizze metaboliten waarden lykwols fûn tusken BN en HC.
KEGG-paadferrikingsanalyse fan signifikant ferskillende metaboliten yn 'e LA-groep yn ferliking mei de BN- en HC-groepen.In twa-tailed Globaltest waard brûkt, en p-wearden waarden oanpast mei de Holm-Bonferroni-metoade (oanpast p ≤ 0.001 en effektgrutte> 0.01).b-d Fioele plots dy't hypoxanthine, xanthine, lactate, pyruvate, en tryptofan nivo's sjen litte yn serum HC, BN, en LA bepaald troch LC-MS / MS (n = 70 per groep).Wite en swarte stippellinen jouwe respektivelik de mediaan en kwartiel oan.e Fioeleplot toant normalisearre Log2TPM (transkripsjes per miljoen) mRNA-ekspresje fan SLC7A5 en QPRT yn longadenokarcinoma (n = 513) yn ferliking mei normaal longweefsel (n = 59) yn 'e LUAD-TCGA-dataset.It wite fak stiet foar it interquartile berik, de horizontale swarte line yn it sintrum stiet foar de mediaan, en de fertikale swarte line dy't út it fak útwreidet stiet foar it 95% betrouwensinterval (CI).f Pearson-korrelaasjeplot fan SLC7A5 en GAPDH-ekspresje yn longadenokarcinoma (n = 513) en normaal longweefsel (n = 59) yn 'e TCGA-dataset.It grize gebiet stiet foar de 95% CI.r, Pearson korrelaasje koëffisjint.g Normalisearre sellulêre tryptofan-nivo's yn A549-sellen transfekteare mei net-spesifike shRNA-kontrôle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) bepaald troch LC-MS / MS.Statistyske analyze fan fiif biologysk ûnôfhinklike samples yn elke groep wurdt presintearre.h Sellulêre nivo's fan NADt (totaal NAD, ynklusyf NAD + en NADH) yn A549-sellen (NC) en SLC7A5-knockdown A549-sellen (Sh1, Sh2).Statistyske analyze fan trije biologysk ûnôfhinklike samples yn elke groep wurdt presintearre.i Glycolytic aktiviteit fan A549 sellen foar en nei SLC7A5 knockdown waard metten troch ekstracellular acidification rate (ECAR) (n = 4 biologysk ûnôfhinklike samples per groep).2-DG,2-deoksy-D-glucose.Twa-tailed Student's t-test waard brûkt yn (b–h).Yn (g-i) fertsjintwurdigje flaterbalken de gemiddelde ± SD, elk eksperimint waard trije kear ûnôfhinklik útfierd en de resultaten wiene ferlykber.Boarnegegevens wurde levere yn 'e foarm fan boarnegegevensbestannen.
Sjoen de signifikante ynfloed fan feroare tryptofan-metabolisme yn 'e LA-groep, beoardielje wy ek serumtryptofaannivo's yn' e HC-, BN- en LA-groepen mei QQQ.Wy fûnen dat serum tryptofan waard fermindere yn LA yn ferliking mei HC of BN (p <0.001, figuer 5d), wat oerienkomt mei eardere befiningen dat sirkulearjende tryptofan-nivo's leger binne yn pasjinten mei longkanker dan yn sûne kontrôles fan 'e kontrôtgroep33,34 ,35.In oare stúdzje mei PET/CT-tracer 11C-methyl-L-tryptofaan fûn dat de retinsjetiid fan tryptofan-sinjaal yn longkankerweefsel signifikant ferhege waard yn ferliking mei goedaardige lesions as normaal weefsel36.Wy hypoteze dat de fermindering fan tryptofan yn LA-serum aktive tryptofan-opname kin reflektearje troch longkankersellen.
It is ek bekend dat it einprodukt fan 'e kynurenine-paad fan tryptofan-katabolisme NAD + 37,38 is, dat in wichtich substraat is foar de reaksje fan glyceraldehyd-3-fosfaat mei 1,3-bisphosphoglycerate yn glycolysis39.Wylst eardere stúdzjes har rjochte hawwe op 'e rol fan tryptofan-katabolisme yn ymmúnregulaasje, sochten wy it ynteraksje tusken tryptofan-dysregulaasje en glycolytyske paden te ferklearjen dy't yn 'e hjoeddeistige stúdzje beoardiele binne.Solute transporter famylje 7 lid 5 (SLC7A5) is bekend as in tryptofan transporter43,44,45.Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) is in enzyme dat streamôfwerts leit fan 'e kynurenine-paad dat kinolinsäure omsette yn NAMN46.Ynspeksje fan 'e LUAD TCGA-dataset die bliken dat sawol SLC7A5 as QPRT signifikant opregulearre waarden yn tumorweefsel yn ferliking mei normaal weefsel (Fig. 5e).Dizze ferheging waard waarnommen yn stadia I en II, lykas stadia III en IV fan longadenokarcinoma (oanfoljende figuer 11), wat oanjout op iere fersteuringen yn tryptofan metabolisme ferbûn mei tumorigenesis.
Derneist toande de LUAD-TCGA-dataset in positive korrelaasje tusken SLC7A5 en GAPDH mRNA-ekspresje yn kankerpasjintenmonsters (r = 0.45, p = 1.55E-26, figuer 5f).Yn tsjinstelling, waard gjin signifikante korrelaasje fûn tusken sokke gen-signatures yn normaal longweefsel (r = 0.25, p = 0.06, figuer 5f).Knockdown fan SLC7A5 (oanfoljende figuer 12) yn A549-sellen fermindere sellulêre tryptofan en NAD (H) nivo's signifikant (figuer 5g, h), wat resulteart yn attenuated glycolytic aktiviteit as mjitten troch ekstrazellulêre acidification rate (ECAR) (Figure 1).5i).Sa, basearre op metabolike feroarings yn serum en in vitro-deteksje, hypoteze wy dat tryptofan-metabolisme NAD + kin produsearje fia de kynurenine-paad en in wichtige rol spylje by it befoarderjen fan glycolyse yn longkanker.
Stúdzjes hawwe sjen litten dat in grut oantal ûnbepaalde pulmonary nodules ûntdutsen troch LDCT kin liede ta de needsaak foar ekstra testen lykas PET-CT, longbiopsy, en overtreatment troch in falsk-positive diagnoaze fan malignancy.31 As werjûn yn figuer 6, ús stúdzje identifisearre in paniel fan serum metabolites mei potinsjele diagnostyske wearde dy't kin ferbetterje risiko stratification en dêropfolgjende behear fan pulmonary nodules ûntdutsen troch CT.
Pulmonary nodules wurde evaluearre mei help fan lege-dosis computed tomography (LDCT) mei imaging funksjes suggestive fan goedaardige of maligne oarsaken.De ûnwisse útkomst fan nodules kin liede ta faak ferfolchbesites, ûnnedige yntervinsjes en overtreatment.It opnimmen fan serummetabolike klassifisearrings mei diagnostyske wearde kin risiko-evaluaasje ferbetterje en it folgjende behear fan pulmonale nodules.PET positron emisje tomografy.
Gegevens fan 'e US NLST-stúdzje en de Jeropeeske NELSON-stúdzje suggerearje dat screening fan groepen mei hege risiko's mei leechdosis komputearre tomografy (LDCT) de mortaliteit fan longkanker kin ferminderje1,3.Risiko-evaluaasje en folgjende klinyske behear fan grutte oantallen ynsidintele pulmonêre nodules ûntdutsen troch LDCT bliuwe lykwols it meast útdaagjend.It haaddoel is om de juste klassifikaasje fan besteande LDCT-basearre protokollen te optimalisearjen troch betroubere biomarkers op te nimmen.
Bepaalde molekulêre biomarkers, lykas bloedmetaboliten, binne identifisearre troch longkanker te fergelykjen mei sûne kontrôles15,17.Yn 'e hjoeddeistige stúdzje rjochte wy ús op' e tapassing fan serummetabolomika-analyze om te ûnderskieden tusken goedaardige en maligne pulmonêre nodules dy't ynsidinteel ûntdutsen binne troch LDCT.Wy fergelike de globale serummetabolom fan sûne kontrôle (HC), goedaardige longnodules (BN), en stadium I longadenokarcinoma (LA) samples mei UPLC-HRMS-analyse.Wy fûnen dat HC en BN ferlykbere metabolike profilen hiene, wylst LA signifikante feroaringen toande yn ferliking mei HC en BN.Wy identifisearre twa sets serummetaboliten dy't LA ûnderskiede fan HC en BN.
It hjoeddeistige LDCT-basearre identifikaasjeskema foar goedaardige en maligne nodules is benammen basearre op 'e grutte, tichtens, morfology en groeisnelheid fan nodules oer tiid30.Eardere ûndersiken hawwe oantoand dat de grutte fan nodules nau besibbe is oan de kâns op longkanker.Sels yn pasjinten mei heech risiko is it risiko fan maligniteit yn knopen <6 mm <1%.It risiko fan maligniteit foar nodules mjitten 6 oant 20 mm farieart fan 8% oant 64%30.Dêrom advisearret de Fleischner Society in cutoff diameter fan 6 mm foar routine CT follow-up.29 Risiko-evaluaasje en behear fan ûnbepaalde pulmonêre nodules (IPN) grutter dan 6 mm binne lykwols net adekwaat útfierd 31 .Aktuele behear fan oanberne hert sykte is meastentiids basearre op waaksend wachtsjen mei faak CT-monitoring.
Op grûn fan it validearre metabolome demonstrearren wy foar it earst de oerlap fan metabolomyske hantekeningen tusken sûne yndividuen en goedaardige nodules <6 mm.De biologyske oerienkomst is yn oerienstimming mei eardere CT-befinings dat it risiko fan maligniteit foar nodules <6 mm sa leech is as foar ûnderwerpen sûnder knopen. oerienkomst yn metabolomyske profilen, wat suggerearret dat de funksjonele definysje fan goedaardige etiology konsekwint is, nettsjinsteande nodulegrutte.Sa kinne moderne diagnostyske serummetabolitepanels in inkele assay leverje as in útslutende test as nodules yn earste ynstânsje ûntdutsen wurde op CT en potensjeel serial monitoring ferminderje.Tagelyk ûnderskiede itselde paniel fan metabolike biomarkers maligne nodules ≥6 mm yn grutte fan goedaardige nodules en levere krekte foarsizzingen foar IPN's fan ferlykbere grutte en dûbelsinnige morfologyske funksjes op CT-ôfbyldings.Dizze klassifikaasje fan serummetabolisme prestearre goed yn it foarsizzen fan de maligniteit fan nodules ≥6 mm mei in AUC fan 0.927.Mei-inoar, jouwe ús resultaten oan dat unike serum metabolomyske hantekeningen spesifyk kinne reflektearje iere tumor-induzearre metabolike feroarings en potinsjele wearde hawwe as risikofoarsizzers, ûnôfhinklik fan nodulegrutte.
Opmerklik binne longadenokarcinoma (LUAD) en plaveiselcelcarcinoma (LUSC) de haadtypen fan net-lytse sel longkanker (NSCLC).Sjoen dat LUSC sterk assosjearre is mei tabakgebrûk47 en LUAD de meast foarkommende histology is fan ynsidintele longnodules ûntdutsen op CT-screening48, waard ús klassifikaasjemodel spesifyk boud foar stadium I adenokarsinoommonsters.Wang en kollega's rjochte har ek op LUAD en identifisearre njoggen lipide-hantekeningen mei lipidomica om longkanker yn 'e iere faze te ûnderskieden fan sûne persoanen17.Wy hifke it hjoeddeistige klassifikaasjemodel op 16 gefallen fan poadium I LUSC en 74 goedaardige nodules en observearre lege LUSC-foarsizzing-krektens (AUC 0.776), wat suggerearret dat LUAD en LUSC har eigen metabolomyske hantekeningen hawwe kinne.Yndied, LUAD en LUSC binne oantoand te ferskillen yn etiology, biologyske komôf en genetyske ôfwikingen49.Dêrom moatte oare soarten histology opnommen wurde yn trainingsmodellen foar populaasje-basearre deteksje fan longkanker yn screeningprogramma's.
Hjir identifisearren wy de seis meast feroare paden yn longadenokarcinoma yn ferliking mei sûne kontrôles en goedaardige nodules.Xanthine en hypoxanthine binne mienskiplike metabolites fan it purine metabolike paad.Yn oerienstimming mei ús resultaten waarden intermediates ferbûn mei purine-metabolisme signifikant ferhege yn it serum of weefsels fan pasjinten mei longadenokarcinoma yn ferliking mei sûne kontrôles as pasjinten op it preinvasive stadium15,50.Ferhege serumxanthine- en hypoxanthine-nivo's kinne it anabolisme reflektearje dat nedich is troch rap proliferearjende kankersellen.Dysregulaasje fan glukoazemetabolisme is in bekend skaaimerk fan kankermetabolisme51.Hjir observearren wy in signifikante ferheging fan pyruvate en laktaat yn 'e LA-groep yn fergeliking mei de HC- en BN-groep, wat oerienkomt mei eardere rapporten fan glycolytyske paadôfwikingen yn' e serummetabolomprofilen fan net-lytse sel longkanker (NSCLC) pasjinten en sûn kontrôles.de resultaten binne konsekwint52,53.
Wichtich, wy observearre in omkearde korrelaasje tusken pyruvate en tryptofan metabolisme yn it serum fan long adenocarcinomas.Serum tryptofan-nivo's waarden fermindere yn 'e LA-groep yn ferliking mei de HC- of BN-groep.Ynteressant fûn in eardere grutskalige stúdzje mei in prospective kohort dat lege nivo's fan sirkulearjend tryptofan ferbûn wiene mei in ferhege risiko fan longkanker 54 .Tryptofan is in essensjeel aminosoer dat wy folslein krije fan iten.Wy konkludearje dat serum tryptofan útputting yn lung adenocarcinoma kin reflektearje flugge útputting fan dizze metabolite.It is bekend dat it einprodukt fan tryptofan-katabolisme fia de kynurenine-paad de boarne is fan de novo NAD + synteze.Om't NAD + primêr wurdt produsearre fia it salvagepaad, bliuwt it belang fan NAD + yn tryptofanmetabolisme yn sûnens en sykte te bepalen46.Us analyze fan 'e TCGA-database liet sjen dat de ekspresje fan' e tryptofan-transporter solute-transporter 7A5 (SLC7A5) signifikant ferhege waard yn longadenokarcinoma yn fergeliking mei normale kontrôles en wie posityf korrelearre mei de ekspresje fan it glycolytyske enzyme GAPDH.Eardere ûndersiken hawwe benammen rjochte op 'e rol fan tryptofan-katabolisme by it ûnderdrukken fan 'e antitumor-ymmúnrespons40,41,42.Hjir demonstrearje wy dat remming fan tryptofan-opname troch knockdown fan SLC7A5 yn longkankersellen resulteart yn in folgjende fermindering fan sellulêre NAD-nivo's en in bygeande fermindering fan glycolytyske aktiviteit.Gearfetsjend jout ús stúdzje in biologyske basis foar feroaringen yn serummetabolisme ferbûn mei maligne transformaasje fan longadenokarcinoma.
EGFR-mutaasjes binne de meast foarkommende bestjoerdermutaasjes yn pasjinten mei NSCLC.Yn ús stúdzje fûnen wy dat pasjinten mei EGFR-mutaasje (n = 41) algemiene metabolomyske profilen hienen fergelykber mei pasjinten mei wyldtype EGFR (n = 31), hoewol wy fûnen fermindere serumnivo's fan guon EGFR-mutante pasjinten yn acylcarnitine-pasjinten.De fêststelde funksje fan acylcarnitines is it ferfier fan acylgroepen út it cytoplasma yn 'e mitochondriale matrix, dy't liedt ta de oksidaasje fan fatty soeren om enerzjy 55 te meitsjen.Yn oerienstimming mei ús befinings identifisearre in resinte stúdzje ek ferlykbere metabolomeprofilen tusken EGFR-mutant- en EGFR-wyldtype-tumors troch it analysearjen fan it globale metabolom fan 102 longadenokarcinoma-weefselmonsters50.Ynteressant waard ek acylcarnitine-ynhâld fûn yn 'e EGFR-mutante groep.Dêrom, oft feroaringen yn acylcarnitine-nivo's reflektearje troch EGFR-induzearre metabolike feroarings en de ûnderlizzende molekulêre paden kinne fierdere stúdzje fertsjinje.
Ta beslút, ús stúdzje stelt in serum metabolic klassifikaasje foar de differinsjaaloperator diagnoaze fan pulmonary nodules en stelt in workflow dy't kin optimalisearje risiko beoardieling en fasilitearje klinysk behear basearre op CT-scan screening.
Dizze stúdzje waard goedkard troch it Ethics Committee fan Sun Yat-sen University Cancer Hospital, it First Affiliated Hospital fan Sun Yat-sen University, en it Ethics Committee fan Zhengzhou University Cancer Hospital.Yn 'e ûntdekkings- en ynterne validaasjegroepen waarden 174 sera fan sûne yndividuen en 244 sera fan goedaardige nodules sammele fan yndividuen dy't jierlikse medyske ûndersiken ûndergeane by de ôfdieling fan kankerkontrôle en previnsje, Sun Yat-sen University Cancer Center, en 166 goedaardige nodules.serum.Stage I longadenokarcinomen waarden sammele fan Sun Yat-sen University Cancer Center.Yn 'e eksterne falidaasjekohort wiene d'r 48 gefallen fan goedaardige nodules, 39 gefallen fan poadium I longadenokarcinoma fan it First Affiliated Hospital fan Sun Yat-sen University, en 24 gefallen fan poadium I longadenokarcinoma fan Zhengzhou Cancer Hospital.Sun Yat-sen University Cancer Center sammele ek 16 gefallen fan poadium I squamous cell longkanker om it diagnostyske fermogen fan 'e fêststelde metabolike klassifikaasje te testen (pasjintskaaimerken wurde werjûn yn oanfoljende tabel 5).Samples fan 'e ûntdekkingskohort en ynterne falidaasjekohort waarden sammele tusken jannewaris 2018 en maaie 2020. Samples foar de eksterne falidaasjekohort waarden sammele tusken augustus 2021 en oktober 2022. Om geslachtsfoaroardielen te minimalisearjen, waarden sawat likense oantallen manlike en froulike gefallen tawiisd oan elk kohort.Discovery Team en Internal Review Team.It geslacht fan de dielnimmers waard bepaald op basis fan selsrapportaazje.Ynformearre tastimming waard krigen fan alle dielnimmers en gjin kompensaasje waard levere.Underwerpen mei goedaardige nodules wiene dy mei in stabile CT-scanscore op 2 oant 5 jier op 'e tiid fan analyze, útsein 1 gefal fan' e eksterne falidaasjeprobe, dy't preoperatively sammele en diagnostearre waard troch histopatology.Mei útsûndering fan groanyske bronchitis.Lung adenocarcinoma gefallen waarden sammele foar longreseksje en befêstige troch patologyske diagnoaze.Fasting bloedmonsters waarden sammele yn serum skieding buizen sûnder anticoagulants.Bloedmonsters waarden 1 oere by keamertemperatuer klotsen en dan sintrifugeare by 2851 × g foar 10 minuten by 4 ° C om serumsupernatant te sammeljen.Serum aliquots waarden beferzen by -80 ° C oant metabolite ekstraksje.De ôfdieling kankerprevinsje en medysk ûndersyk fan it Sun Yat-sen University Cancer Center sammele in pool fan serum fan 100 sûne donateurs, ynklusyf in gelikense oantal manlju en froulju fan 40 oant 55 jier.Gelikense voluminten fan elke donormonster waarden mingd, it resultearjende swimbad waard aliquotearre en opslein by -80 ° C.It serummingsel waard brûkt as referinsjemateriaal foar kwaliteitskontrôle en gegevensstanderdisearring.
Referinsjeserum en testproblemen waarden ûntdutsen en metaboliten waarden ekstrahearre mei in kombineare ekstraksjemetoade (MTBE / methanol / wetter) 56 .Koartsein waard 50 μl serum mingd mei 225 μl iiskâlde methanol en 750 μl iiskâlde methyl-tert-butylether (MTBE).Roer it mingsel en ynkubearje op iis foar 1 oere.De samples waarden doe mingd en vortex mingd mei 188 μl fan MS-grade wetter mei ynterne noarmen (13C-lactate, 13C3-pyruvate, 13C-methionine, en 13C6-isoleucine, kocht fan Cambridge Isotope Laboratories).It mingsel waard doe sintrifuge op 15.000 × g foar 10 min by 4 ° C, en de legere faze waard oerbrocht yn twa buizen (125 μL elk) foar LC-MS-analyse yn positive en negative modi.Uteinlik waard it probleem ferdampt oant droech yn in hege snelheid fakuümkonsintrator.
De droege metaboliten waarden rekonstituearre yn 120 μl 80% acetonitril, vortexed foar 5 min, en sintrifuge by 15.000 × g foar 10 min by 4 ° C.Supernatants waarden oerbrocht yn amber glêzen vials mei mikro-ynserts foar metabolomics stúdzjes.Untargeted metabolomics-analyze op in ultra-performance floeistofchromatografy-hege resolúsje massaspektrometrie (UPLC-HRMS) platfoarm.Metaboliten waarden skieden mei in Dionex Ultimate 3000 UPLC-systeem en in ACQUITY BEH Amide-kolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters).Yn positive ionmodus wiene de mobile fazen 95% (A) en 50% acetonitril (B), elk mei 10 mmol / L ammoniumacetat en 0,1% mieresûr.Yn negative modus befette mobile fazen A en B respektivelik 95% en 50% acetonitril, beide fazen befette 10 mmol / L ammoniumacetate, pH = 9. It gradientprogramma wie as folget: 0-0,5 min, 2% B;0,5-12 min, 2-50% B;12–14 min, 50–98% B;14–16 min, 98% B;16–16.1.min, 98 –2% B;16.1-20 min, 2% B. De kolom waard bewarre op 40 ° C en it probleem op 10 ° C yn 'e autosampler.De streamsnelheid wie 0,3 ml / min, it ynjeksjevolume wie 3 μl.In Q-Exactive Orbitrap massaspektrometer (Thermo Fisher Scientific) mei in boarne fan elektrosprayionisaasje (ESI) waard operearre yn folsleine scanmodus en keppele oan de ddMS2-monitoringmodus om grutte voluminten gegevens te sammeljen.De MS-parameters waarden as folget ynsteld: spuitspanning +3,8 kV/- 3,2 kV, kapillêre temperatuer 320 °C, beskermingsgas 40 arb, helpgas 10 arb, sondeheatertemperatuer 350 °C, scanberik 70–1050 m/h, resolúsje.70 000. Gegevens waarden oankocht mei Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Om gegevenskwaliteit te beoardieljen, waarden sammele kwaliteitskontrôle (QC) samples generearre troch 10 μL aliquots fan 'e supernatant út elke stekproef te ferwiderjen.Seis kwaliteitskontrôle sample-ynjeksjes waarden analysearre oan it begjin fan 'e analytyske folchoarder om de stabiliteit fan it UPLC-MS-systeem te beoardieljen.Kwaliteitskontrôlemonsters wurde dan periodyk yn 'e batch ynfierd.Alle 11 batches fan serummonsters yn dizze stúdzje waarden analysearre troch LC-MS.Aliquots fan in serum pool-mingsel fan 100 sûne donateurs waarden brûkt as referinsjemateriaal yn respektivelike batches om it ekstraksjeproses te kontrolearjen en oan te passen foar batch-to-batch-effekten.Untargeted metabolomics-analyze fan 'e ûntdekkingskohort, ynterne falidaasjekohort, en eksterne falidaasjekohort waard útfierd by it Metabolomics Center fan Sun Yat-sen University.It eksterne laboratoarium fan Guangdong University of Technology Analysis and Testing Center analysearre ek 40 samples fan 'e eksterne kohort om de prestaasjes fan it klassifikaasjemodel te testen.
Nei ekstraksje en rekonstitúsje waard absolute kwantifikaasje fan serummetaboliten mjitten mei ultra-hege prestaasjes floeistofchromatografy-tandem massaspektrometrie (Agilent 6495 triple quadrupole) mei in electrospray ionisaasje (ESI) boarne yn meardere reaksjemonitoring (MRM) modus.In ACQUITY BEH Amide-kolom (2.1 × 100 mm, 1.7 μm, Waters) waard brûkt om metaboliten te skieden.De mobile faze bestie út 90% (A) en 5% acetonitril (B) mei 10 mmol / L ammonium acetate en 0,1% ammoniak oplossing.It gradientprogramma wie as folget: 0-1,5 min, 0% B;1,5-6,5 min, 0-15% B;6,5-8 min, 15% B;8–8,5 min, 15%–0% B;8,5-11,5 min, 0%B.De kolom waard hâlden op 40 ° C en it probleem op 10 ° C yn 'e autosampler.De flow rate wie 0,3 mL / min en it ynjeksje folume wie 1 μL.MS parameters waarden ynsteld as folget: capillary voltage ± 3,5 kV, nebulizer druk 35 psi, sheath gas flow 12 L / min, sheath gas temperatuer 350 ° C, droege gas temperatuer 250 ° C, en drogen gas flow 14 l / min.De MRM-konversaasjes fan tryptofan, pyruvate, lactate, hypoxanthine en xanthine wiene 205.0-187.9, 87.0-43.4, 89.0-43.3, 135.0-92.3 en 151.0-107.9 respektive.Gegevens waarden sammele mei help fan Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Foar serummonsters waarden tryptofan, pyruvate, lactate, hypoxanthine, en xanthine kwantifisearre mei kalibraasjekurven fan standertmixoplossingen.Foar selmonsters waard tryptofan-ynhâld normalisearre nei de ynterne standert en selproteinmassa.
Peak-ekstraksje (m / z en retinsjetiid (RT)) waard útfierd mei Compound Discovery 3.1 en TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Om potinsjele ferskillen tusken batches te eliminearjen, waard elke karakteristike peak fan 'e testmonster dield troch de karakteristike peak fan it referinsjemateriaal út deselde batch om de relative oerfloed te krijen.De relative standertôfwikingen fan ynterne noarmen foar en nei standerdisearring wurde werjûn yn oanfoljende tabel 6. Ferskillen tusken de twa groepen waarden karakterisearre troch falske ûntdekkingsrate (FDR <0.05, Wilcoxon ûndertekene rangtest) en foldwiziging (> 1.2 of <0.83).Raw MS-gegevens fan 'e ekstrahearre funksjes en referinsjeserum-korrigearre MS-gegevens wurde respektivelik werjûn yn Supplementary Data 1 en Supplementary Data 2.Peak annotaasje waard útfierd op basis fan fjouwer definieare nivo's fan identifikaasje, ynklusyf identifisearre metabolites, putative annotearre ferbiningen, putative karakterisearre ferbiningsklassen, en ûnbekende ferbiningen 22.Op grûn fan database-sykopdrachten yn Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider), waarden biologyske ferbiningen mei MS / MS oerienkommende falidearre noarmen as eksakte match-annotaasjes yn mzCloud (skoare> 85) of Chemspider úteinlik selektearre as intermediates tusken it differinsjaal metaboloom.Peak annotaasjes foar elke funksje binne opnommen yn Supplementary Data 3. MetaboAnalyst 5.0 waard brûkt foar univariate analyze fan som-normalisearre metabolite-oerfloed.MetaboAnalyst 5.0 evaluearre ek KEGG-paadferrikingsanalyse basearre op signifikant ferskillende metaboliten.Principal component analysis (PCA) en partiel minste kwadraten diskriminaasje analyse (PLS-DA) waarden analysearre mei it ropls softwarepakket (v.1.26.4) mei stack normalisearring en autoscaling.De optimale metabolite biomarker model foar it foarsizzen fan nodule malignancy waard oanmakke mei help fan binêre logistyske regression mei syn minst absolute krimp en seleksje operator (LASSO, R pakket v.4.1-3).De prestaasjes fan it diskriminearjende model yn 'e deteksje- en validaasjesets waard karakterisearre troch it skatten fan AUC basearre op ROC-analyse neffens it pROC-pakket (v.1.18.0.).De optimale kâns cutoff waard krigen basearre op de maksimale Youden yndeks fan it model (sensitiviteit + spesifisiteit - 1).Samples mei wearden minder as grutter dan de drompel sille wurde foarsein as respektivelik goedaardige nodules en longadenokarcinoma.
A549-sellen (#CCL-185, American Type Culture Collection) waarden groeid yn F-12K-medium mei 10% FBS.Koarte haarspjeld RNA (shRNA) sekwinsjes rjochte op SLC7A5 en in nontargeting kontrôle (NC) waarden ynfoege yn de lentivirale vector pLKO.1-puro.De antisense-sekwinsjes fan shSLC7A5 binne as folget: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′).Antistoffen tsjin SLC7A5 (#5347) en tubulin (#2148) waarden kocht fan Cell Signaling Technology.Antykladen tsjin SLC7A5 en tubulin waarden brûkt yn in verdunning fan 1:1000 foar Western blot-analyse.
De Seahorse XF Glycolytic Stress Test mjit nivo's fan ekstrazellulêre fersuring (ECAR).Yn 'e assay waarden glukoaze, oligomycin A, en 2-DG sequentieel administreare om sellulêre glycolytyske kapasiteit te testen lykas mjitten troch ECAR.
A549-sellen transfekteare mei net-targeting-kontrôle (NC) en shSLC7A5 (Sh1, Sh2) waarden oernachtich pleatst yn skûtels mei in diameter fan 10 sm.Selmetaboliten waarden ekstrahearre mei 1 ml iiskâlde 80% wetterige methanol.Sellen yn 'e methanol-oplossing waarden ôfskrapt, sammele yn in nije buis, en sintrifuge op 15.000 × g foar 15 min by 4 ° C.Sammelje 800 µl supernatant en droegje mei in hege snelheid fakuümkonsintrator.De droege metabolite pellets waarden doe analysearre foar tryptofan-nivo's mei LC-MS / MS lykas hjirboppe beskreaun.Sellulêre NAD(H)-nivo's yn A549-sellen (NC en shSLC7A5) waarden mjitten mei in kwantitative NAD+/NADH-kolorimetryske kit (#K337, BioVision) neffens de ynstruksjes fan de fabrikant.Proteinnivo's waarden mjitten foar elke stekproef om it bedrach fan metaboliten te normalisearjen.
Gjin statistyske metoaden waarden brûkt om foarôf te bepalen fan de stekproefgrutte.Foarige metabolomics-stúdzjes rjochte op ûntdekking fan biomarkers15,18 binne beskôge as benchmarks foar grutte bepaling, en yn ferliking mei dizze rapporten wie ús stekproef adekwaat.Gjin samples waarden útsletten fan 'e stúdzjekohort.Serum-samples waarden willekeurich tawiisd oan in ûntdekkingsgroep (306 gefallen, 74.6%) en in ynterne falidaasjegroep (104 gefallen, 25.4%) foar untargeted metabolomics-stúdzjes.Wy hawwe ek willekeurich selekteare 70 gefallen út elke groep út 'e ûntdekking set foar rjochte metabolomicsstúdzjes.De ûndersikers waarden ferbline foar groepopdracht tidens LC-MS-gegevenssammeling en -analyse.Statistyske analyzes fan metabolomics gegevens en sel eksperiminten wurde beskreaun yn de respektivelike Resultaten, Figure Legends, en Metoaden seksjes.Kwantifikaasje fan sellulêre tryptofan, NADT, en glycolytyske aktiviteit waard trije kear ûnôfhinklik útfierd mei identike resultaten.
Foar mear ynformaasje oer it stúdzjeûntwerp, sjoch it Natural Portfolio Report Abstract ferbûn mei dit artikel.
De rau MS-gegevens fan 'e ekstrahearre funksjes en de normalisearre MS-gegevens fan it referinsjeserum wurde respektivelik werjûn yn Supplementary Data 1 en Supplementary Data 2.Peak-annotaasjes foar differinsjaalfunksjes wurde presintearre yn Supplementary Data 3. De LUAD TCGA-dataset kin downloade wurde fan https://portal.gdc.cancer.gov/.De ynfiergegevens foar it plotjen fan 'e grafyk wurde levere yn' e boarnegegevens.Boarne gegevens wurde levere foar dit artikel.
Nasjonale Lung Screening Study Group, ensfh.Noard Ingelân.J. Med.365, 395-409 (2011).
Kramer, BS, Berg, KD, Aberle, DR en Prophet, PC.J. Med.Skerm 18, 109–111 (2011).
De Koning, HJ, et al.Ferminderjen fan longkanker mortaliteit mei volumetryske CT-screening yn in randomisearre proef.Noard Ingelân.J. Med.382, 503–513 (2020).
Post tiid: Sep-18-2023